Диссертация (1144752), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Ген WUS экспрессируется в особой группе клеток - «организующемцентре» ПАМ и контролирует размер популяции прилегающих к ОЦстволовыхклеток,поддерживаяихпролиферациюипрепятствуядифференцировке (Yadav et al., 2011). Известно, что ТФ WUS стимулируетэкспрессию гена, кодирующего CLV3 пептид. В свою очередь, через системурецепторов CLAVATA CLV3-пептид активирует сигнальный путь, которыйподавляет транскрипцию WUS, что ограничивает локализацию этого ТФзоной организующего центра (Schoof et al., 2000; Brand et al., 2000). Сходнымобразом паралоги генов WUS и CLV3 (WOX5 и CLE40), а также рецепторнаякиназа ACR4 (Arabidopsis Crinkly4) контролируют размер популяциистволовых клеток в апикальной меристеме корня (КАМ) (Stahle et al., 2009).МеханизмывлиянияWOXнаподдержаниенедифференцированногосостояния стволовых клеток в настоящее время остаются малоизученными.Однако установлено, что кроме генов CLE, мишенями действия ТФ WOXявляются регуляторы первичного ответа на цитокинины.
Например, уарабидопсиса ТФ WUS подавляет экспрессию генов ответа на цитокинины –ARR А-типа (негативных регуляторов ответа на цитокинины). Такимобразом,мишенямидействияТФWOXявляютсягены,которыеконтролируют передачу сигнала от цитокининов, что локально усиливаетдействие этих гормонов (Leibfried et al., 2005). Вероятно, усиление действия192цитокининов влияет на поддержание недифференцированного статусастволовых клеток в ПАМ.Механизмы регуляции пролиферации и дифференцировки клеток приформировании специализированных латеральных органов – симбиотическихклубеньков - изучены недостаточно. Однако установлено, что важную роль вконтролепроцессацитокининыиформированияауксины.Дляклубеньковизученияиграютвозможныхфитогормонымолекулярныхмеханизмов, влияющих на изменение баланса гормонов при органогенезеклубеньковугороха,намибылпроведенпоискпредставителейтранскрипционных факторов семейств KNOX и WOX, необходимых дляконтроля формирования клубеньков и изучено их взаимодействие срегуляторами биосинтеза гормонов, а также ответа растений на действиеэтих гормонов.Задачами данного раздела исследований являлись:1.Изучение роли генов KNOX в развитии клубеньков гороха P.
sativum L.2.Анализ влияния транскрипционных факторов KNOX на уровеньэкспрессии генов, контролирующих метаболизм цитокининов у гороха.3.Идентификация и анализ генов WOX у гороха, а также изучение их ролив процессе формирования симбиоза.4.1 Изучение роли генов KNOX в развитии клубеньков гороха P. sativumL.4.1.1 Идентификация генов семейства KNOX, играющих существеннуюроль в контроле формирования клубеньков у гороха.У гороха P. sativum L. в настоящее время были клонированы два генасемейства KNOX, KNOX1 (AF080104) и KNOX2 (AF080105) (Hofer et al.,1932001).
Было показано, что гены PsKNOX1 и PsKNOX2 у P. sativum являютсягомологами STM и KNAT1/BP, соответственно (Tattersall et al. 2005). Длявыявления новых представителей этого семейства нами был проведенскрининг четырех транскриптомных баз данных (TSA, Transcriptome ShotgunAssembly) гороха (TSA): (Zhukov et al., unpublished), BioProject: PRJNA66035(Franssen et al., 2011), BioProject: PRJNA81209 (Kaur et al., 2012) и BioProject:PRJNA211622 (Duarte et al., 2014)) с помощью известных в настоящее времяпоследовательностей KNOX1 – KNOX10 генов модельного бобового M.truncatula. В результате были выявлены полноразмерные и частичныетранскрипты, соответствующие 9 предполагаемым KNOX генам гороха. Дваизних,PsKNOX1иPsKNOX2соответствовалипредварительноохарактеризованным генам.
На следующем этапе были подобраны праймерык нуклеотидным последовательностям P. sativum либо фланкирующиепредполагаемые полноразмерные KNOX транскрипты, либо специфичные кчастичным KNOX транскриптам. Последующий RACE анализ позволилидентифицировать набор полноразмерных кДНК гороха, которые былианнотированы как PsKNOX3 – PsKNOX6, KNOX8, KNOX9 и KNOX10 (номерапоследовательностей в GenBank KP296686, KP296687, KP296688, KP296689,KP296690, KP296691, KP296692). Все выявленные гены показали высокийуровень гомологии с соответствующими KNOX кДНК M.
truncatula.Анализ уровня экспрессии всех девяти выявленных генов PsKNOXпроводили в процессе развития клубеньков у гороха линии Frisson приинокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026 (рисунок 60). Среди всехизученныхгеновэкспрессиягенаPsKNOX3наиболеесущественновозрастала в процессе развития симбиоза (Azarakhsh et al., 2015). Эти данныесоответствуют результатам, полученным и при анализе экспрессии геновсемейства KNOX у другого бобового растения M. truncatula (Azarakhsh et al.,2015). Таким образом, нами был выявлен ген KNOX3 семейства KNOX генову гороха, который активируется в процессе формирования симбиоза.
Это194Рисунок 60. Анализ экспрессии генов PsKNOX в корнях гороха линии Frisson в ответ на инокуляцию Rh.leguminosarum bv. viciae CIAM1026.NI – non-inoculated (без инокуляции, dpi – days post inoculation (дни после инокуляции)).195указывает на то, что«классический» регулятор пролиферации идифференцировки клеток в регулярных меристемах у растений семействаKNOX, играет также важную роль и в формировании клубеньков у гороха.4.1.2. Анализ влияния транскрипционного фактора KNOX3 на уровеньэкспрессии генов, контролирующих метаболизм цитокининов у гороха.На следующем этапе исследований мы проанализировали, какизменения в уровне экспрессии PsKNOX3 могут влиять на гены,контролирующие биосинтез цитокининов. С целью проверить возможноевлияние нами были получены трансгенные растения со сверхэкспрессиейгена PsKNOX3 (ген был клонирован в векторе pB7WG2D под промоторомвируса табачной мозаики 35S).
Отбор трансгенных корней проводили по ихфлюоресцентномусвечению,посколькувсоставевекторадлятрансформации растений также находился ген флюоресцентного белка GFPпод 35S промотором. Мы показали, что уровень экспрессии гена PsKNOX3возрастал в среднем в 20 – 50 раз по сравнению с корнями растений,трансформированных конструкцией, содержащей клонированный под 35Sпромотором ген β-глюкуронидазы (GUS-контроль).Вотсутствииинокуляциинатрансгенныхкорняхгороха35S::PsKNOX3 образовывались спонтанные незараженные клубеньки, чтосвидетельствовало об активации кортикальный делений клеток под влияниемгена PsKNOX3 (рисунок 61) (Azarakhsh et al., 2015).
В отличие от клубеньков,формируемых при симбиозе с ризобиями, у этих клубеньков не была развитапериферическая проводящая система, и вместо нее был сформированцентральный проводящий пучок, что делало такие клубеньки похожими набоковые корни (Azarakhsh et al., 2015). Аналогичный эффект наблюдалитакже при сверхэкспрессии гена MtKNOX3 у M. truncatula (Azarakhsh et al.,2015). Сходные клубенько-подобные структуры с центральным проводящим196пучком были получены у растений L. japonicus при сверхэкспрессии геновNIN и NF-YA1, NF-YB1 (Soyano et al., 2013). Более того, такие структурыбыли обнаружены у мутанта lin-4, у которого клубеньки оставалисьнеинфицированными из-за нарушения развития инфекционных нитей из-заих абортирования в клетках корневых волосков (Guan et al., 2013).Рисунок 61.
Формирование спонтанных клубеньков на трансгенныхрастениях гороха со сверхэкспрессией гена PsKNOX3 (35S::PsKNOX3)(Azarakhsh et al., 2015).Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ТФKNOX3 может действовать однонаправленно с NIN, NF-Y1 и NF-Y2. Все этитранскрипционные факторы активируются после кальций, кальмодулинзависимой киназы (ССаМК) и регулятора IPD3/CYCLOPS у гороха. Приэктопической экспрессии ССаМК и CYCLOPS также образуются спонтанныеклубеньки, но у таких клубеньков нормально развита проводящая система,поэтому они больше напоминают клубеньки, образуемые при инокуляциирастений ризобиями.
Разная морфологическая структура формируемыхклубеньков позволяет предположить, что после фосфорилирования ССаМК,транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS может взаимодействовать снесколькими регуляторами. Только совместное действие этих регуляторовопределяет развитие клубенька с нормально развитой проводящей системой.Одним из таких регуляторов является NIN, который далее активирует197связывающиеся c СААТ-боксом ТФ NF-Y1 и NF-Y2 (рисунок 62). Другиерегуляторы в настоящее время еще не выявлены у бобовых растений.
Будетли таким дополнительным регулятором KNOX3 или KNOX3 действуетвместе в одном пути с NIN, еще предстоит выяснить (рисунок 62). Вместе стем, анализ клубеньков lin-4 мутанта позволяет сделать вывод о том, чтопоявление такого дополнительного регулятора, который вовлечен в передачусигнала послеIPD3/CYCLOPS, может быть опосредовано инфекцией.Рисунок 62. Схема возможного взаимодействия между основнымирегуляторами сигнального пути, активируемого Nod-факторами угороха, и транскрипционным фактором KNOX3.
CSP –общий сигнальныйпуть (от англ. common signal pathway).Ранее выполненные исследования позволили нам идентифицироватьшесть IPT1-6 генов у гороха, экспрессия четырех из них – IPT1, IPT2, IPT3 и198IPT4 – увеличивалась в процессе развития симбиоза у гороха. Нами такжебыло выявлено 6 генов LOG у гороха, четыре из которых индуцировались впроцессе развития симбиоза – LOG1, LOG2, LOG4 и LOG5. С целью выявитьвозможное влияние KNOX3 транскрипционного регулятора на экспрессиюгенов IPT и LOG, мы проанализировали изменения в уровне экспрессии этихгенов в корнях трансгенных растений на фоне сверхэкспрессии генаPsKNOX3 (35S::PsKNOX3). При этом в клубенько-подобных структурах,образованных на 35S::PsKNOX3 трансгенных корнях гороха, как оказалось,был выше уровень экспрессии гена LOG2, контролирующего биосинтезцитокинина, а также регулятора цитокининового ответа RR8 А-типа (рисунок63) по сравнению с клубеньками, образованными на GUS-контрольныхрастениях при инокуляции ризобиями.Рисунок 63.
Анализ экспрессии генов IPT и LOG в корнях трансгенныхрастений гороха со сверхэкспрессией гена PsKNOX3 (35S::PsKNOX3).Нами были также получены растения с подавлением экспрессии генаPsKNOX3 в результате РНК-интерференции (PsKNOX3-RNAi). Мы показали,что на корнях трансгенных растений PsKNOX3-RNAi формировались199клубеньки, при этом их количество не отличалось от количества клубеньков,образованныхнаконтрольныхрастениях,трансформированныхконструкцией GUS-OE (рисунок 64).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
