Диссертация (1144752), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Следовательно, маловероятно, что ТФKNOX3 играет важную роль на начальных этапах закладки клубеньков.Вероятно, он вовлечен в контроль более поздних этапов морфогенезасимбиотических клубеньков у гороха.У растенийс подавлением экспрессии гена PsKNOX3 наблюдалиснижение уровня экспрессии генов PsLOG1, PsLOG2, PsIPT3 и PsRR8(рисунок 64) (Azarakhsh et al., 2015). Это свидетельствует о том, чтотранскрипционный регулятор KNOX3 необходим для индукции экспрессииэтих генов на определенном этапе формирования клубеньков у гороха.Схожим образом, в клубеньках с подавлением экспрессии гена MtKNOX3 уM.
truncatula наблюдали подавление экспрессии генов MtLOG1, MtIPT3, атакже гена первичного ответа на цитокинин MtRR4 (Azarakhsh et al., 2015).Рисунок 64. Анализ экспрессии генов IPT и LOG в корнях трансгенныхрастений гороха с подавленной экспрессией PsKNOX3 в результате РНКинтерференции (PsKNOX3-RNAi).2004.2. Идентификация и анализ генов WOX у гороха, а также изучениеих роли в процессе формирования симбиоза.(Результаты исследований, представленные в разделах 4.2 и 4.3, былиполучены совместно с аспиранткой Cанкт-Петербургского государственногоуниверситетаЛебедевойМариейАлександровной,соруководствокандидатской диссертацией которой осуществлено автором настоящегодиссертационного исследования).В апикальных меристемах растений транскрипционные факторысемейства WOX участвуют в регуляции пролиферации клеток (онистимулируют пролиферацию клеток и подавляют их дифференцировку).Проведенный ранее транскриптомный анализ инокулированных корнеймодельного растения M.
truncatula выявил значительное увеличениеэкспрессии одного из представителей семейства гомеобокс-содержащихтранскрипционных факторов WOX - гена WOX5 (Benedito et al., 2008). Всвязи с этим, мы планировали идентифицировать гомолог гена WOX5 угороха, а также изучить влияние этого транскрипционного фактора напроцесс органогенеза клубеньков.С помощью вырожденных праймеров к консервативным участкам,подобранныхнаоснованиисравнительногоанализануклеотидныхпоследовательностей гена WOX5 M. truncatula и WOX5 A.
thaliana ипоследующей амплификации 5’ и 3’-концов кДНК с помощью процедурыRACE, были определены последовательности полноразмерного гена WOX5, атакже мРНК WOX5 у гороха (Osipova et al., 2012). Это позволило намвыявитьгомологгенаWOX5угороха.Сходствонуклеотидныхпоследовательностей кДНК гороха и люцерны в пределах гомеобоксасоставило 92,7% (рисунок 65), при этом за пределами этого участка сходствоcоставляло - 85,5 %.201Рисунок 65. Сравнительный анализ последовательностей кДНК PsWOX5гороха и MtWOX5 M. truncatula.
Гомеобокс выделен красным цветом.4.2.1. Анализ экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у гороха.Нами был проведен сравнительный анализ экспрессии гена PsWOX5 вкорнях гороха дикого типа Frisson в ответ на инокуляцию ризобиями (с 5 по22 день после инокуляции) и неинокулированных корнях, взятых на тех жесроках развития. Анализ уровня экспрессии гена PsWOX5 показал егоувеличение в инокулированных корнях гороха дикого типа, начиная с 5 - 7дпи. Максимальное увеличение экспрессии гена наблюдали на 11-12 дпи, азатем происходило его снижение к 15 и 22 дпи (рисунок 66) (Osipova et al.,2011, 2012).
На ранних сроках после инокуляции (5 - 7 дпи) в корняхрастений гороха активно протекают процессы деления клеток внутреннихслоев коры и перицикла, приводящие к формированию примордия клубенька(Voroshilova et al., 2009). На этом сроке происходит значительное увеличение202экспрессии гена WOX5 в инокулированных корнях гороха. Следовательно,увеличение может быть связано с активной пролиферацией клетокпримордия клубенька, так как ген WOX5 может быть вовлечен в регуляциюпролиферации клеток.Рисунок 66. Количественный анализ динамики экспрессии гена PsWOX5при развитии клубеньков у гороха линии Frisson методом ОТ-ПЦР вреальном времени (Osipova et al., 2012).Приблизительно на 9-11 дпи происходит значительное увеличениеразмеров примордиев клубеньков, а также наблюдается инфицированиеделящихся клеток примордиев бактериями (Voroshilova et al., 2009).
На этомэтапе уровень экспрессии гена WOX5 достигает максимального значения. Наболее поздних сроках происходит формирование меристемы клубенька ивыход клубенька на поверхность корня. К 15 и 22 дпи происходитзначительное снижение уровня экспрессии гена WOX5. Следовательно,начальное увеличение уровня экспрессии WOX5 по времени совпадает сактивной пролиферацией клеток на ранних этапах развития клубенька(формированием примордия), а достижение максимума экспрессии генаWOX5 (9-11 дпи) предшествует формированию у клубенька собственноймеристемы. При этом дифференцировка тканей клубенька сопровождаетсязначительным снижением уровня экспрессии этого гена. Таким образом,выявленный характер динамики экспрессии гена указывает на его участие в203контроле процесса формирования примордия/меристемы клубенька (Osipovaet al., 2011, 2012).4.2.2.
Локальный анализ экспрессии гена WOX5 при органогенезеклубеньков и изучение влияния ауксина на экспрессию гена WOX5.Для локального анализа экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньковгороха была получена конструкция, содержащая промотор гомологичногогена M. truncatula, слитый с репортерным геном β-глюкуронидазы (GUS)(pМtWOX5::GUS). После введения этой конструкции в растения горохаFrisson, в неинокулированных трансгенных корнях гороха GUS-окрашиваниенаблюдали в кончиках корней в небольшой группе клеток (по-видимому,соответствующей покоящемуся центру апикальной меристемы корня)(Osipova et al., 2012).
По литературным данным экспрессия гена WOX5 быласходным образом локализована в покоящемся центре меристемы корняарабидопсиса (Haecker et al., 2004). Это свидетельствовало о том, чтополученная конструкция была эффективной для изучения локализацииэкспрессии гена WOX5 у гороха.Винокулированныхкорняхтрансформированных конструкциейрастенийгороха(5-7дпи),pMtWOX5::GUS, GUS-окрашиваниенаблюдали в группе делящихся клеток перицикла, эндодермы и коры, чтосоответствует месту закладки примордия клубенька (рисунок 67 a) (Osipovaet al., 2012). На последующих этапах клубенькообразования (9 и 14 дпи)экспрессию гена WOX5 наблюдали в делящихся клетках развивающегосяпримордия клубенька (рисунок 67 б, в).
На более поздних этапах развитияклубенька (21 дпи) экспрессия гена WOX5 сохраняется лишь в областиокончаний проводящих пучков (рисунок 67 г). Активность гена WOX5 былатакже связана с примордиями боковых корней (Osipova et al., 2012).204Рисунок 67. Локальный анализ экспрессии WOX5 (pMtWOX5::GUS) вразвивающихся клубеньках гороха (A-Г). Схема, иллюстрирующаялокализацию экспрессии гена WOX5 на различных этапах развитияклубеньков (Osipova et al., 2012).На рисунке 67 представлена схема, иллюстрирующая локализациюэкспрессии гена WOX5 на различных этапах развития клубенька.
Такимобразом, локальный анализ экспрессии гена WOX5 с помощью генетическойконструкции pMtWOX5::GUS, подтвердил участие гена WOX5 в развитииклубенька. Данные по локализации экспрессии гена WOX5 на различныхэтапах развития клубенька согласуются с данными по динамике экспрессииWOX5, полученными с помощью метода количественной ОТ-ПЦР в реальномвремени (Osipova et al., 2011, 2012). Корреляция этих данных подтверждаетнаше предположение о важной роли транскрипционного фактора WOX5именно в контроле ранних этапов развития клубенька (Osipova et al., 2012).Наблюдаемое снижение экспрессии гена WOX5 на поздних этапах развитияклубенька, выявленное с помощью количественной ОТ-ПЦР, соответствуетограничению зоны экспрессии гена WOX5 в развивающемся клубенькеобластями окончаний проводящих пучков (рисунок 67).На следующем этапе нашей работы было изучено влияние экзогенногогормона ауксина (1-нафтилуксусной кислоты (НУК)) (10-6 М) на экспрессию205гена WOX5.
После обработки НУК было выявлено увеличение экспрессиигена WOX5. При этом максимальное увеличение экспрессии WOX5наблюдали после 6 часов обработки НУК, а после 24 часов обработкипроисходило снижение уровня экспрессии WOX5 (рисунок 68). Такимобразом,экзогеннодобавленныйауксинНУКвызывалувеличениеэкспрессии гена WOX5 (Osipova et al., 2012).Рисунок 68.
Анализ экспрессии гена PsWOX5 в тканях корня гороха приобработке экзогенным ауксином (НУК, 10-6 М) (Osipova et al., 2012).Формированиепримордиевклубеньковсвязанослокальнымнакоплением ауксинов под влиянием Nod-факторов. Полученные намиданные о способности экзогенного ауксина стимулировать экспрессию WOX5соответствуют представлениям о том, что на ранних этапах развитиясимбиоза под влиянием Nod-факторов происходит локальное увеличениеконцентрации ауксинов. Следовательно, активация экспрессии гена WOX5можетопределятьсяименновлияниемэндогенныхауксиновприформировании примордиев клубеньков.4.4.
Анализ влияния транскрипционного фактора WOX5 на регуляторыцитокининового ответа RR А-типа у гороха.Локализация экспрессии гена WOX5 при развитии симбиотическихклубеньковгорохапоказала,что206генэкспрессируетсявклеткахразвивающихся примордиев клубеньков. Сходный характер экспрессии былвыявлен нами и при локализации ответа на цитокинины у растений гороха спомощью цитокинин-регулируемой конструкции, содержащей промотор генаRR А-типа(часть 3 раздела «Результаты и обсуждение»). Такая ко-локализация поднимает вопрос о том, могут ли транскрипционный факторWOX5 и компоненты цитокининового сигнального пути взаимодействоватьмежду собой. Известно, что у арабидопсиса в апикальной меристеме побегатранскрипционный фактор WUS активируется цитокининами и вовлекается влокальную регуляцию цитокининового ответа через подавление экспрессиирегуляторов RR A-типа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
