Диссертация (1144752), страница 34
Текст из файла (страница 34)
При этом ген PsCLE13 не активировался в ответна инокуляцию у мутантов sym9 (PsCaCMK), sym33 (PsIPD3/PsCYCLOPS),sym7 (PsNSP2), sym35 (PsNIN), кодирующих основные компонентысигнального каскада, активируемого Nod-факторами у гороха (рисунок 71 б).Таким образом, нами было продемонстрировано, что ген PsCLE13специфичным образом индуцируется у гороха в процессе развития симбиоза,при этом его активация зависит от компонентов сигнального пути,активируемых Nod-факторами, и происходит после стадии, контролируемойтранскрипционным фактором NIN (sym35).218Рисунок 71. Анализ экспрессии гена PsCLE13 в процессе развитиясимбиоза у растений гороха исходных линий Frisson (А) и SGE (Б), атакже у мутантов по генам sym9 (P54), sym33 (SGEFix--5), sym7 (SGENod-6), sym35 (SGENod--3).5.2АнализвлияниясверхэкспрессииCLE-пептиданаразвитиеклубеньков у растений гороха.На основании ранее выполненных экспериментов было высказанопредположение о том, что CLE-пептиды у модельных бобовых растенийлюцерны M.
truncatula и лядвенца L. japonicus (MtCLE13, LjCLE-RS1, LjCLERS2)могутавторегуляциюявлятьсялигандамиклубенькообразованияCLV-комплекса,(Mortieretвовлеченногоal.2010,в2012).Действительно, сверхэкспрессия специфичных для клубенькообразования219CLE-пептидов (MtCLE13, LjCLE-RS1, LjCLE-RS2) приводила к системномуподавлению клубенькообразования у растений дикого типа. Однако усуперклубенькообразующих мутантов Lotus и Medicago по генам har1 и sunn(кодируют CLV1-подобный ген) сверхэкспрессия таких CLE-пептидов неизменяла способность формировать повышенное количество клубеньков(Okamoto et al.
2009, Mortier et al. 2010). Таким образом, CLE-пептиды могутбыть сигнальными молекулами, которые участвуют в запуске процессаавторегуляции клубенькообразования и действуют на более ранних этапах,чем CLV1-подобный рецептор (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010;Okamoto et al. 2012).Для изучения возможного взаимодействия между CLE-пептидом,специфично активирующимся при клубенькообразовании у гороха, икомпонентамисистемыавторегуляциинамибылииспользованысуперклубенькообразующие мутанты sym29, который содержит мутацию вCLV1-подобном гене (гомолог LjHAR1, MtSUNN), и sym28, имеющимнарушения в CLV2 гене (гомолог LjCLV2, MtCLV2), соответственно.Если негативное влияние CLE-пептидов у гороха осуществляется привзаимодействии с рецепторами, работающими в побеге, то мы ожидалиувидеть отсутствие изменений в фенотипе суперклубенькообразующихмутантов гороха sym29 и sym28 при сверхэкспрессии гена, кодирующегоспецифичный для клубенькообразования CLE-пептид.
Для изучения влияниясверхэкспрессии CLE-пептида на процесс клубенькообразования у горохабыла получена конструкция, содержащая ген люцерны MtCLE13 подконтролем промотора 35S (CLE-OE). Последовательность выявленного намиCLE-пептида гороха имела высокий уровень сходства с CLE-пептидомлюцерны MtCLE13, на основании этого мы полагали, что ген люцерныMtCLE13 будет работать в геноме гороха.2205.3.1.АнализвлияниясверхэкспрессииCLE-пептиданаклубенькообразование гороха дикого типа и суперклубенькообразующихмутантов гороха с нарушением побеговой системы авторегуляции P88(sym 29) и P64 (sym 28).ДляоценкиклубенькообразованиевлияниясверхэкспрессиипроросткигорохалинииCLE-пептидаFrissonнабылитрансформированы штаммами A.
rhizogenes, содержащими конструкции длясверхэкспрессии 35S::MtCLE13 (CLE-OE) и 35S::GUS (GUS-контроль).Подсчет количества клубеньков проводили на 21 дпи, при этом учитывалитолько клубеньки, образованные на трансгенных корнях гороха.У растений гороха линии Frisson эктопическая экспрессия MtCLE13приводила к значительному подавлению клубенькообразования. В то времякак в контрольном варианте (GUS-OE) на корнях растений Frissonобразовались в среднем 35 клубеньков нормальной морфологии на растение,только у нескольких растений Frisson, трансформированных CLE-OE,наблюдалось формирование единичных клубеньков на трансгенных корнях(были выявлены в среднем 2 недоразвитых клубенька на растение,соответственно) (рисунок 72) (Osipova et al., 2012).Рисунок 72. Внешний вид корней растений гороха дикого типа Frisson,трансформированных GUS-OE (A) (контроль) и CLE-OE (B) (Osipova etal., 2012).221Таким образом, у трансгенных растений дикого типа сверхэкспрессияMtCLE13 приводила к значительному снижению количества клубеньков изамедлению развития редких образующихся клубеньков, что свидетельствуето системном подавлении клубенькообразования у растений дикого типа.Нами был также проведен анализ влияния сверхэкспрессии MtCLE13на фенотип суперклубенькообразующих мутантов гороха P88 (sym29) и P64(sym28).
В отличие от растений исходной линии Frisson, у которой присверхэкспрессии CLE-пептида наблюдалось значительное уменьшениеколичестваобразующихсяклубеньков,накорняхмутантовsym29(нарушения в CLV1-подобном гене) и sym28 (содержит мутацию в CLV2гене),содержащихконструкцию35S::MtCLE13,формировалосьзначительное количество клубеньков, также как и в контроле (GUS-OE)(рисунок73)(Osipovaтрансформированныхetal.,растенийсуперклубенькообразующим2012).Такиммутантовфенотипом.образом,корнихарактеризовалисьСледовательно,влияниесверхэкспрессии MtCLE13 (CLE-OE) не проявлялось в корнях мутантов погенам, кодирующим компоненты побеговой системы авторегуляции.Рисунок 73. Суперклубенькообразующий фенотип трансгенных корнеймутантов sym29 (A, B) и sym28 (C, D) со сверхэкспрессией MtCLE13(Osipova et al., 2012).222Полученные данные об отсутствии влияния сверхэкспрессии MtCLE13на суперклубенькообразующий фенотип мутанта sym29, несущего мутацию вCLV1-подобном гене, согласуются с известными ранее в литературеданными, полученными для мутантов лядвенца и люцерны, несущих мутациив ортологичных генах (LjHAR1, MtSUNN, соответственно) (Okamoto et al.2009, Mortier et al.
2010). Это подтверждает наличие сходных механизмовавторегуляции клубенькообразования у различных видов бобовых растений сучастием CLE-пептидов.5.4 Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на экспрессию генов,кодирующих рецептор Sym10 и транскрипционный фактор NIN,(компонент сигнального каскада, активируемый Nod-факторами).На следующем этапе исследований нами было изучено влияниеэктопической экспрессии гена MtCLE13 на изменение экспрессии генов,кодирующих компоненты (рецептор Sym10 и транскрипционный регуляторNIN) активируемого Nod-факторами сигнального пути у гороха.При сверхэкспрессии CLE-пептида было выявлено существенноеснижение экспрессии гена Sym10, кодирующего рецептор к Nod-факторам, винокулированных корнях гороха (рисунок 74). Эффект был зависим от CLV1и CLV2 рецепторов, поскольку у мутантов по генам sym28 и sym29 уровеньэкспрессии гена Sym10 не изменялся по сравнению с контролем (GUS-OE).Вместе с тем, у растений гороха со сверхэкспрессией MtCLE13 мынаблюдали значительное снижение экспрессии гена NIN, кодирующеготранскриционный фактор, который специфично активируется при запускесигнального каскада, ведущего к клубенькообразованию (рисунок 74).223Рисунок 74.
Анализ экспрессии генов Sym10 и NIN в трансгенных корняхгороха Frisson и суперклубенькообразующих мутантов sym28 и sym29 сосверхэкспрессией MtCLE13 (35S::MtCLE13, CLE-OE). В качестве контролябыли использованы растения, трансформированные 35S::GUS.Эти данные хорошо согласуются с тем, что сверхэкспрессияспецифичного CLE-пептида приводила к подавлению клубенькообразованияу растений гороха дикого типа. Это указывает на то, что снижениеспособностикформированиюклубеньковугорохаопределялосьвзаимодействием между системными и локальными механизмами регуляцииклубенькообразования.
Таким образом, негативное влияние CLE-пептида наклубенькообразование осуществляется через систему рецепторов CLV исвязано с подавлением экспрессии основных регуляторов, контролирующихинициацию процесса клубенькообразования у гороха таких, как Sym10рецептор, а также транскрипционный фактор NIN, участвующий в передачесигнала.5.5. Изучение взаимодействия гена WOX5 и компонентов системыCLAVATA при развитии клубеньков у гороха.5.5.1.
Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у224растений гороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантовДля изучения возможного взаимодействия WOX5 с компонентамисистемы CLAVATA (CLV), мы провели анализ экспрессии гена WOX5 усуперклубенькообразующихмутантовснарушениемавторегуляцииклубенькообразования – sym29 (мутация в CLV1-подобном гене) и sym28(мутация в CLV2 гене). Если WOX5 является мишенью системы CLAVATA, тонарушение функции CLV-1 и CLV-2 рецепторов, являющихся компонентамипобеговой системы авторегуляции, должно приводить к изменению уровняэкспрессии этого гена у мутантов.5.5.2.АнализэкспрессииPsWOX5усуперклубенькообразующихмутантов гороха sym29 и sym28НамибылпроведенанализэкспрессиигенаPsWOX5усуперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 на различных срокахпосле инокуляции с помощью количественной ПЦР, совмещенной с обратнойтранскрипцией и детекцией продуктов реакции в реальном времени (ОТПЦР) (рисунок 75).Анализ показал, что у мутантов гороха sym29 и sym28 максимумэкспрессии наблюдается раньше, чем у растений дикого типа Frisson.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
