Диссертация (1141404), страница 19
Текст из файла (страница 19)
woronowii являются эфир III,35,04%), 2,9,10-триметокси-(1α,2α)-3,12-дидегидрогалантан-1-ол (IV, 16,00%), I,(14,86%), этил-α-D-глюкопиранозид (V, 7,00%), 1,5-ангидро-L-рамнит (VI, 6,59%). Следует отметить значительное содержание I и его биосинтетическогопредшественника IV, наличие и количественное содержание данного алкалоидаявляется важными показателями, как с точки зрения фармакологическойактивности ГомЛС, так и для аналитических целей при подтверждении качестваготового препарата. Соединения V и VI – являются также мажорными(преобладающими) веществами в комплексе БАС, играют ведущую роль вкачестве структурных компонентов клеток растений.
Соединение VII, входит всостав флавоноидной фракции, несмотря на незначительное содержание (0,73%)обладает выраженной противомикробной и противовоспалительной активностью[144], для него отмечено также цитотоксическое действие в экспериментах in vitro[150].В число доминирующих компонентов НГМ G. nivalis.входят левоглюкозан(VIII, 27,88%), 4,5-этилен-8,9-диметокси-6-фенантридон (IX, 12,71%), 1-метокси3-(2-гидроксиэтил)-нонан(X,10,74%),2-бутилфенол(XI,6,97%),3-изопропоксифенил метил карбонат (XII, 8,47%).
Левоглюкозан (VIII) – изомерэлементарного звена, образующего целлюлозу, поэтому его присутствие можетсвидетельствовать о возможной деполимеризационной термической деструкцииданного полисахарида. Содержание ликорина (II) незначительно – 0,15%, однакоего можно считать маркёром для данного ГомЛС, при этом отмечаетсяприсутствие в достаточных количествах соединения IX, которое принимаетучастие в биосинтезе данного алкалоида.124Общими компонентами для двух видов НГМ являются сахара (V, XIII)),эфир III и замещенный пиран VII. Следует обратить внимание на тот факт, что вНГМ указанные соединения, за исключением последнего, присутствуют в формепростых эфиров с этиловым спиртом (этилированные производные).5.2.
Изучение амариллисовых алкалоидов НГМ подснежников5.2.1. Подтверждение присутствия амариллисовых алкалоидов в НГМподснежников качественными реакциямиДля подтверждения присутствия АА в НГМ двух видов подснежниковпроводиликачественныереакциисобщеалкалоиднымиосадительнымиреактивами, как при исследовании извлечений из ГомЛРС.Методика для проведения качественных реакций на АА в НГМ(Приложение4,6.«ПОДЛИННОСТЬ»Определениеосновныхгруппбиологически активных веществ п. 3. Качественная реакция на амариллисовыеалкалоиды).
Результаты качественных реакций представлены в таблице 5.2.1.1.Таблица 5.2.1.1.Результаты качественных реакций на АА в НГМ G. woronowii и G. nivalis№ Реактив (название)1.Реактив Драгендорфа2.3.4.5.6.7.Результат реакцииОсадок кирпичнокрасного цветаРеактив Вагнера-Бушарда- Осадок бурого цветаЛюголяРеактив БертранаОсадок белого цветаРеактив ЗонненштейнаОсадок желтоватого цветаРеактив ШейблераОсадок желтоватого цвета1 % водный р-рОсадок желтого цветапикриновой кислотыРаствор танинаОсадок белого цветаG. woronowii+G. nivalis+++++++++++++В НГМ подснежников, как и в ГомЛРС, присутствуют АА в достаточныхколичествах.Далеепроводилосьисследованиеалкалоидной фракции НГМ методом ТСХ.компонентногосостава1255.2.2. Изучение состава амариллисовых алкалоидов НГМ подснежниковметодом ТСХ.Методика проведения ТСХ анализа НГМ представлена в Приложении 4 и 6«ПОДЛИННОСТЬ», Определение основных групп биологически активныхвеществ п.
1. Тонкослойная хроматография (амариллисовые алкалоиды).1,00,90,80,70,60,50,40,30,20,11Рис.5.2.2.1.Схема2хроматограммы3ААНГМ4подснежниковрастворителей диэтиловый эфир – метанол – диэтиламин (90:5:5)1. – НГМ G. woronowii3. – СО галантамина2. – НГМ G. nivalis4. – СО ликоринавсистеме126ДляпроведенияТСХ-анализаиспользовалиужехорошозарекомендовавшую себя систему растворителей диэтиловый эфир – метанол –диэтиламин (90:5:5). При проведении ТСХ-анализа НГМ подснежников былииспользованы те же условия и реактивы, что и при исследовании ГомЛРС.На хроматограмме НГМ G.
woronowii и G. nivalis присутствовали зоныадсорбции соответствующие Rf СО галантамина (Rf= 0,58) и ликорина (Rf= 0,10),а также зоны адсорбции других АА (рис. 5.2.2.1).5.2.3. Изучение состава амариллисовых алкалоидов НГМ подснежниковметодом ГХ-МСХроматограммы извлечений из НГМ G. woronowii и G. nivalis представленына рис. 5.2.3.1. Формулы идентифицированных АА НГМ видов подснежниковпредставлены на рис.
5.2.3.2, остальные формулы представлены на рис. 4.1.3.2 вразделе (4.1.3) определения АА в ГомЛРС.ИдентификацияААпроводиласьпосопоставлениюмасс-спектрасоединения и масс-спектра эталона из библиотеки, как в случае анализа ГомЛРС.В таб. 5.2.3.1 представлены основные ГХ-МС данные: время удерживания,основные пики масс-спектра, относительное содержание для каждого соединения.В ходе ГХ-МС анализа было идентифицировано 5 АА в НГМ G. woronowii и5 АА в НГМ G. nivalis.x10 6 +EI TIC Scan 2016_05_31_voronova_ngm.d3.8А* 22.312503204.153.63.443.23Galanthan-1-ol,3,12-didehydro2,9,10-trimethoxy-,(1α,2β)-12.82.62.4Galanthamine52.2221.8* 17.83933790.991.41.23Lycorine,2,4-didehydro-2-deshydroxy1.6LycorinTazettine1* 22.74284704.540.80.60.4* 21.4244766.34* 19.1256009.770.2017.417.617.81818.218.418.618.81919.219.419.619.82020.2 20.4 20.6 20.8Counts vs.
Acquisition Time (min)2121.221.421.621.82222.222.422.622.82323.2127x10 5 +EI TIC Scan 2016_05_31_belosnejnii_ngm.d3.83.643.4Tazettine3.23Б* 21.4933528.091Michelalbine2.852.6* 19.31028527.022.43LycorineCriwelline,6a-desoxy-6-methoxy2.221.8* 22.9862210.742Tazettine, 6a-deoxy-1.6* 20.9166211.241.4* 19.8137884.911.210.818.2 18.4 18.6 18.81919.2 19.4 19.6 19.82020.2 20.4 20.6 20.8 21 21.2 21.4 21.6 21.8Counts vs. Acquisition Time (min)2222.2 22.4 22.6 22.82323.2Рис.
5.2.3.1. ГХ-хроматограммы извлечений из НГМ:(А) G. woronowii:1 – галантамин, 2 – 2,4-дидегидро-2-десгидрокси-ликорин, 3 –тацеттин, 4 – галантин, 5 –ликорин;(Б) G. nivalis: 1 –микелалбин, 2 – 6α-деокси-тацеттин 3 – 6α-дезокси-6-метоксикривеллин, 4 – тацеттин, 5 – ликорин.Таблица 5.2.3.1.Данные ГХ-МС извлечений из НГМ G. woronowii и G. nivalis1.2.3.СоединениеRT,мингалантамин17,82,4-дидегидро-2десгидроксиликоринмикелалбин19,119.34.6α-деокситацеттин19,85.6α-дезокси-6метоксикривеллинтацеттин20,96.21,47.галантин22,38.ликорин22,722,9m/z999 (287), 905 (286), 606 (42), 414 (216), 379 (174),305 (115), 301 (44), 275 (244), 210 (43), 288 (179)999 (250), 645 (251), 630 (96), 438 (50), 361 (62), 339(77), 325 (268), 284 (84), 281 (65), 264 (89)999 (281), 929 (280), 379 (252), 299 (251), 269 (262),263 (219), 282 (161), 253 (57), 264 (31), 283 (20)999 (70), 710 (231), 616 (42), 560 (44), 371(45), 359(300), 315 (313), 196 (115), 232 (134),185 (123)999 (70), 775 (42), 666 (75), 350 (314), 341 (44), 330(82), 261 (258), 211 (45), 181 (113), 313 (173),999 (247), 891 (42), 812 (44), 808 (70), 620 (45), 618(71), 331 (297), 291 (115), 201 (188), 181 (167)999 (242), 982 (243), 349 (317), 244 (200), 184 (125),268 (174), 316 (143), 162 (140), 127 (41), 123 (45)999 (226), 780 (227), 358 (44), 280 (18), 242 (28), 287(212), 186 (147), 268 (162), 155 (119), 144 (111)Относительноесодержание, %G.G.woron nivalisowii–18,54–1,2132,88–4,41–5,311,1529,84–58,9120,1927,56128HO1O2OONNOOOРис.
5.2.3.2. Формулы АА: 1 –2,4-дидегидро-2-десгидрокси-ликорин; 2 – 6αдеокси-тацеттинВ извлечении из НГМ G. woronowii идентифицированы: галантамин, 2,4дидегидро-2-десгидрокси-ликорин, тацеттин, галантин, ликорин; В извлечении изНГМ G. nivalis определены: микелалбин, 6α-деокси-тацеттин, 6α-дезокси-6метокси-кривеллин, тацеттин, ликорин.В НГМ двух видов подснежников, как и в ГомЛРС, присутствуютгалантамин (G.
woronowii – 18,54%) и ликорин (G. woronowii – 20,19% и G. nivalis– 27,56%).5.2.4. Количественное определение суммы амариллисовых алкалоидов вНГМ подснежников методом СФМОпределение содержания суммы АА проводили аналогичным методом, чтои для ГомЛРС.Для количественного определения АА в НГМ G. woronowii и G. nivalis мыпроводили следующие операции:10 мл НГМ G. woronowii и G. nivalis упаривали досуха. К остаткуприбавляли 10 мл воды очищенной, 5 мл 1 % р-ра кислоты соляной,перемешивали и переносили в делительную воронку вместимостью 50 мл, затемприбавляли 10 мл хлороформа, 1 мл 1 % р-ра тропеолина 000-II и встряхивали втечение 3-5 минут, отделяли органическую фазу и фильтровали свозь фильтр с 3 гнатрия сульфата безводного, смоченного предварительно 5 мл хлороформа, вмерную колбу вместимостью 25 мл.
Извлечение повторяли еще два раза 10 и 5 млхлороформа, встряхивая при этом в течение 2-3 минут, органический слой129отделяли и фильтровали в ту же колбу сквозь тот же фильтр. Хлороформноеизвлечение в мерной колбе доводили тем же растворителем до метки,перемешивали и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны484±2 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм. В качестве растворасравнения использовали хлороформ.Параллельно измеряли оптическую плотность р-ра СО галантамина: около0,01 г СО галантамина (точная навеска) растворяли в 25 мл хлороформа в мернойколбе объемом 100 мл, доводили хлороформом до метки (раствор А). 1 млполученного раствора помещали в мерную колбу на 100 мл, доводилихлороформом до метки (раствор Б). 2 мл раствора Б СО галантамина помещали вделительную воронку вместимостью 50 мл, затем прибавляли 8 мл хлороформа,10 мл воды очищенной, 5 мл 1 % р-ра кислоты соляной, 1 мл 1 % р-ра тропеолина000-II, встряхивали в течение 3-5 минут, отделяли органическую фазу ифильтровали через фильтр с 3 г натрия сульфата безводного, смоченного 5 млхлороформа, в мерную колбу вместимостью 25 мл, далее проводили извлечениехлороформом дважды (10 и 5 мл), как указано выше.Расчет содержания суммы АА в НГМ G.
woronowii проводили в пересчетена галантамин, а в НГМ G. nivalis в пересчете на ликорин.Содержание суммы АА в пересчете на галантамин/ликорин в процентах Xвычисляли по формуле:=·· 25 · 100=· · 25·· 100·где:– оптическая плотность испытуемого раствора;– оптическая плотность раствора РСО галантамина;– объем настойки, взятой для определения, в мл;– масса СО галантамина/ликорина в граммахСумма АА в НГМ G. woronowii в пересчёте на галантамин составила0,084±0,005 %, а в НГМ G.
nivalis в пересчёте на ликорин – 0,063±0,003 %.130Метрологические характеристики методики количественного определения суммыАА представлена в таб. 5.2.4.1.Таблица 5.2.4.1.Метрологические характеристики методики количественного определения суммыАА в НГМ двух видов подснежников (n = 5, f = 4, P = 95%, T(f,P) = 2,7764)ХОбъектSΔXE,%G. woronowii0,0841,6·10-50,00390,00180,0055,82G. nivalis0,0637,3·10-60,00270,00120,0035,295.3.Изучение флавоноидов НГМ подснежниковПри анализе НГМ G.
woronowii была получена ВЭЖХ-хроматограмма,представленная на рис. 5.3.1, где наблюдается 5 интенсивных пиков.QBA127DMP-030315-7%1002.414.14111-Mar-2015 13:16:121: Scan ES+3174.92e8417.380DMP-030315-720.002.4030.001: Scan ES+2872.98e8100I, II%3.55VII, VIII00.00DMP-030315-313.567.8310.0020.004.109.3430.002: Diode Array360Range: 3.574e-16.0e-12: Diode Array360Range: 6.106e-14.0e-12.0e-10.00.00DMP-030315-3%2.247.135.5613.5210.0017.3520.0014.5010.002.0900.0020.001: Scan ES+TIC1.09e104.0712.055.709.33Time30.0020.005.681.3510.00DMP-030315-7AU30.001: Scan ES+3031.24e813.5600.01: Scan ES+3036.24e8%2.067.182.0e-120.005.732.7120.001: Scan ES+2871.79e818.1410.00100AUDMP-030315-710.0004-Mar-2015 16:56:06IX, X5.58 8.98 12.58023.1300.00DMP-030315-3%10010.006.85100III, IV, V, VI9.38QBA127DMP-030315-3%310.0014.5419.3820.0027.74TimeРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
