Диссертация (1141404), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Тонкослойная хроматография (флавоноиды)Приготовление растворовРаствор стандартного образца (СО) кверцетина. Около 0,005 г СОкверцетина (кверцетина дигидрата) растворяют в 10 мл 96 % спирта этиловогопри перемешивании до полного растворения. Срок годности раствора не более 3мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.Раствор стандартного образца (СО) кемпферола. Около 0,005 г СОизорамнетина растворяют в 10 мл 96 % спирта этилового при перемешивании дополного растворения.
Срок годности раствора не более 3 мес при хранении впрохладном, защищенном от света месте.Алюминия хлорида раствор 5 %. 5,0 г алюминия хлорида безводного или 9,0г алюминия хлорида 6-водного растворяют в 80 мл спирта этилового 70%,фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора темже спиртом до метки. Срок годности раствора 3 мес.5 мл настойки упаривают на водяной бане, остаток высушивают всушильном шкафу при 110 °С в течение 10 минут, затем добавляют 10 мл 15%серной кислоты, перемешивают до растворения осадка. Полученный растворпомещают в коническую колбу, объемом 100 мл, присоединяют к обратномухолодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 2 часов. Послеохлаждения до комнатной температуры полученное извлечение фильтруют черезбумажный фильтр. Осадок, оставшийся на фильтре, промывают водойочищенной, высушивают в сушильном шкафу при 110 °С в течение 10 минут ирастворяют в 5 мл горячего 96% этанола (испытуемый раствор).На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоемсиликагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером10 × 15 см наносят 20 мкл испытуемого раствора, рядом наносят 10 мкл растворастандартного образца СО кверцетина и СО кемпферола.
Пластинку с251нанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в камеру, предварительнонасыщенную в течение 1 ч смесью растворителей н-бутанол – уксусная кислоталедяная – вода (4:1:2), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронтрастворителя пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, еевынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, затемобрабатывают алюминия хлорида раствором 5 % в спирте 70 %, после чегопросматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.На хроматограмме раствора СО кверцетина должна обнаруживаться зонаадсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета, на хроматограмме раствораСО кемпферола также должна обнаруживаться зона адсорбции с флуоресценциейжелто-зеленого цвета.Нахроматограммеиспытуемогорастворадолжныобнаруживатьсяследующие зоны адсорбции: зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленогоцвета на уровне зоны адсорбции на хроматограмме раствора СО кверцетина; зонаадсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета на уровне зоны адсорбции нахроматограммераствораСОкемпферола;допускаетсяобнаружениедополнительных зон адсорбции (флавоноиды).3.
К 1 мл НГМ прибавляют 3 мл воды, 3-5 капель 1% растворакремневольфрамовой кислоты. Появляется муть, переходящая в хлопьевидныйосадок (амариллисовые алкалоиды).4. К 3 мл настойки прибавляют 0,1 г порошка магния и 1 млконцентрированной кислоты хлористоводородной разведенной; постепеннодолжно появиться розовое окрашивание (флавоноиды).5.
1 мл настойки помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл,приливают 20 мл этилового спирта 70%, перемешивают и доводят тем же спиртомдо метки (испытуемый раствор). УФ-спектр испытуемого раствора в области длинволн от 300 до 450 нм должен иметь максимум поглощения при длине волны 330±5нм.252ИСПЫТАНИЯТяжелые металлы. Не более 0,001 % (ГФ XIII).Сухой остаток.
Не менее 1,5 % (ГФ XIII).Плотность. От 0,898 до 0,918 (ГФ XIII).Микробиологическаячистота.Испытанияпроводятвсоответствиистребованиями ОФС «Микробиологическая чистота» ГФ XIII, категория 3.2.»Количественное определение. Суммы амариллисовых алкалоидов впересчете на ликорин не менее 0,004 %.Сумма амариллисовых алкалоидовПриготовление растворовАцетата аммония раствор 20 Ммоль/л в воде. Около 1,542 г (точнаянавеска) ацетата аммония переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл,доводят водой для хроматографии до метки и перемешивают. При необходимостипроводят дегазацию и фильтрацию через мембранный фильтр с размером пор неболее 0,45 мкм.Приготовление подвижной фазы.
В мерную колбу вместимостью 1 л вносят100 мл ацетата аммония раствора 20 Ммоль/л в воде, добавляют 500 млацетонитрила и перемешивают, доводят объем колбы до метки ацетонитрилом иснова перемешивают.Приготовление стандартных растворов ликорина. Около 20 мг (точнаянавеска) субстанции ликорина растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл вацетонитриле и доводят до метки тем же растворителем, получая стандартныйраствор ликорина концентрацией 200 мкг/мл (раствор А2). 10 мл раствора А2помещали в мерную колбу на 100 мл и доводят объем колбы тем жерастворителем до метки, получая раствор концентрацией 20 мкг/мл (раствор Б2).
1мл раствора А2 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили объем колбы темже растворителем до метки, получая раствор концентрацией 2 мкг/мл (растворВ2).Приготовление калибровочных растворов ликорина.Для приготовления калибровочных растворов с концентрациейстандартного раствора ликорина 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 25,0; 50,0 мкг/мл проводятразбавление стандартных растворов ацетонитрилом в соответствии с таблицей 1.Таблица1.Приготовление калибровочных растворов ликоринаКонцентрацияКонцентрацияОбъемОбъемкалибровочногостандартногостандартногокалибровочногораствора, мкг/млраствора, мкг/млраствора, млраствора, мл2,5200,12512535,0200,25110,0200,5115,0200,75125,02000,125150,02000,251Растворы хранят в плотно закрытой емкости в холодильнике не более 1 мес.Проверка пригодности хроматографической системы.Результаты анализа считаются достоверными, если выполняютсяследующие условия:1.
эффективность хроматографической колонки должна быть не менее не менее14 000 для пика ликорина;2. коэффициент симметрии для пика ликорина должен быть не менее 0,8 и неболее 1,5.1,5 мл настойки переносят в мерную колбу, вместимостью 25 мл, доводятобъем до метки подвижной фазой. 2 мл полученного раствора центрифугируют втечение 5 мин при 4500 об/мин. 1 мл надосадочной жидкости помещают в виалыдля хроматографирования (испытуемый раствор).Условия хроматографированияКолонка- 150×4,6 мм, сорбент поверхностнопористый непривитый силикагель (С18), 2,7мкм (HILIC)Предколонка- 5×4,6 мм, сорбент поверхностнопористый непривитый силикагель (С18), 2,7мкм (HILIC)ПФСмесь ацетонитрила с ацетата аммонияраствором 20 Ммоль/л в воде (9:1)Способ элюирования- изократическийСкорость потока- 0,8 мл/минТемпература- 35± 2°СколонкиДетектор- спектрофотометрический или диоднаяматрицаДлина волны- 290 нм254Объем пробы- 20 мклВремя записи данных- 20 минХроматографируют калибровочный раствор СО ликорина с концентрацией10 мкг/мл, получая не менее 3 хроматограмм.
Результаты считаютсядостоверными, если выполняются требования теста «Проверка пригодностихроматографической системы».Хроматографируют последовательно калибровочные растворы и строяткалибровочный график зависимости площади СО ликорина от его концентрации.Затемхроматографируютиспытуемыйраствор,получаянеменее3хроматограмм.Расчет содержания суммы амариллисовых алкалоидов проводят методомвнешнего стандарта. Обсчету подлежат пик ликорина, а также пики со спектрами,характерными для амариллисовых алкалоидов (максимумы поглощения при 235 и290 нм).Содержание суммы амариллисовых алкалоидов в пересчете на ликорин внастойке гомеопатической матричной в процентах (X) вычисляют по формуле:=·· 25,· · 10000Где: S – сумма площадей пиков ликорина и других амариллисовых алкалоидовна хроматограмме испытуемого раствора;So − площадь пика на хроматограмме раствора СО ликорина;– концентрация стандартного раствора, мкг/мла – аликвота настойки, мл;Содержание суммы амариллисовых алкалоидов в пересчете на ликорин внастойке гомеопатической матричной в процентах (X), используя калибровочныйграфик, вычисляют по формуле:· 25=,· 10000где: С – содержание суммы амариллисовых алкалоидов в 1 мл испытуемогораствора, найденное по калибровочному графику, мкг;а – аликвота настойки, мл.Испытание на четвертое десятичное разведение D4.
Хроматографируютобразец четвертого десятичного разведения в соответствии с требованиями,изложенными в разделе «Количественное определение». На полученной в255результате анализа хроматограмме должен отсутствовать пик со временемудерживания соответствующий ликорину.ПримечаниеПриготовление четвертого десятичного разведения D4 производят всоответствии с ОФС «Настойки гомеопатические матричные».Упаковка.
В соответствии с требованиями ОФС «Гомеопатическиелекарственные формы».Упаковка должна обеспечивать стабильность при транспортировании ихранении в течение установленного срока годности.Маркировка.ВсоответствиистребованиямиОФС«Настойкигомеопатические матричные».Хранение. В защищенном от света месте при температуре от 15 до 25 °С.Зав. кафедры фармакогнозииИнститута фармации и трансляционной медициныФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченовадокт. фарм. наук, член-корр. РАНИ.А.
Самылина«___» __________201__г.Аспиранткафедры фармакогнозииИнститута фармации и трансляционной медициныФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. СеченоваД.О. Боков«___» __________201__г..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
