Диссертация (1141404), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Волоски представляют собой эпидермальные выросты длиной до350 мкм. Клетки коровой паренхимы тонкостенные, округлой формы (35-45 мкм)с многочисленными межклетниками различного размера и формы. Внутренняячасть коры имеет клетки овально-многоугольной формы, которые удлинены врадиальном направлении (35-45 мкм). Центральный осевой цилиндр малогодиаметра (55-60 мкм). Древесинная часть корня состоит, как правило, из одногокрупного сосуда и четырех лучей сосудов малого диаметра (тетрархное строение).Флоэма представлена также четырьмя лучами.
Эндодерма выражена нечетко.21512aaРис. 1. Верхний эпидермис листа (1), нижний эпидермис листа (2). a - устьичныйкомплекс. Увел. 400×aРис. 2. Рафиды оксалата кальция в клетках мезофилла листа. Увел. 400×.21612Рис. 3. Эпидермис листочка околоцветника с внешней стороны. 1 – клеткиэпидермиса; 2 – сосочковидные выросты. Увел. 400×.12aРис. 4. Эпидермис наружной чешуи с внешней стороны (1), клетки паренхимызапасающей чешуи (2). a – крахмальные зерна. Увел. 400×.217Определение основных групп биологически активных веществ1. Тонкослойная хроматография (амариллисовые алкалоиды)Приготовление растворовПриготовление раствора стандартного образца (СО) галантамина.
Около10,0 мг (точная навеска) СО галантамина основания помещают в мерную колбувместимостью 10 мл и растворяют в 8 мл 96 % спирта этилового приперемешивании. Доводят объём раствора тем же спиртом до метки иперемешивают. Срок хранения раствора 1 мес.Приготовление раствора стандартного образца (СО) ликорина. Около 10,0мг (точная навеска) СО ликорина основания помещают в мерную колбувместимостью 10 мл и растворяют в 8 мл 96 % спирта этилового приперемешивании. Доводят объём раствора тем же спиртом до метки иперемешивают. Срок хранения раствора 1 мес.Приготовление модифицированного реактива Драгендорфа.
Раствор I. 0,85г висмута нитрата основного растворяют в 40 мл воды и 10 мл уксусной кислоты,взбалтывают в течение 15 мин. Раствор II. 8 г калия йодида растворяют в 20 млводы. Растворы I и II смешивают (основной раствор). Непосредственно передприменением 10 мл основного раствора смешивают с 10 мл 1 % водного растворааскорбиновой кислоты и 10 мл 95 % этанола.Приготовление уксусной кислоты 20 %. 20,4 г уксусной кислотыразбавляют водой до 100 мл.Навеску 2,0 г измельчённого в ступке до кашицеобразного состояния сырьяпомещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 30мл 10% раствора аммиака, выдерживают в течение 30 мин при постоянномперемешивании.
Затем добавляют 15 мл хлороформа и встряхивают в течение 30мин. Хлороформное извлечение сливают и повторяют операцию ещё два раза сновыми порциями хлороформа (по 15 мл). Извлечения объединяют, хлороформотгоняют и выпаривают досуха.Полученный остаток растворяют в 30 мл 10% раствора соляной кислоты.Кислый раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр, подщелачиваютраствором аммиака до pH= 9, затем снова последовательно экстрагируютхлороформом 3 раза по 20 мл. Извлечения объединяют, добавляют 10 гбезводного сульфата натрия, перемешивают и фильтруют через складчатыйбумажный фильтр.
Затем хлороформ отгоняют, полученный остаток растворяют в3 мл метанола (испытуемый раствор).218На стартовую линию аналитической хроматографической пластинки сослоем силикагеля на алюминиевой основе размером 10×15 см наносят раздельнополосами 50 мкл испытуемого раствора и 5 мкл СО галантамина и СО ликорина.Пластинкуснанесеннымипробамисушатнавоздухе,помещаютвхроматографическую камеру, предварительно насыщенную в течение 1 часасмесью: диэтиловый эфир – метанол – диэтиламин (90:5:5) и хроматографируютвосходящим способом в указанной системе растворителей. Когда фронтрастворителей пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта,пластинку вынимают, высушивают на воздухе до удаления следов растворителей.Затем пластинку обрабатывают модифицированным реактивом Драгендорфа инагревают в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С в течение 5 мин.На хроматограмме раствора СО ликорина должна обнаруживаться зонаадсорбции оранжевого цвета; на хроматограмме раствора СО галантамина – зонаадсорбции оранжевого цвета.Нахроматограммеиспытуемогорастворадолжныобнаруживатьсяследующие зоны: зона оранжевого цвета на уровне зоны СО ликорина; зонаоранжевого цвета на уровне зоны СО галантамина; допускается обнаружениедополнительных зон.2.
Тонкослойная хроматография (флавоноиды)Приготовление растворовРаствор стандартного образца (СО) кверцетина. Около 0,005 г СОкверцетина (кверцетина дигидрата) растворяют в 10 мл 96 % спирта этиловогопри перемешивании до полного растворения. Срок годности раствора не более 3мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.Раствор стандартного образца (СО) изорамнетина. Около 0,005 г СОизорамнетина растворяют в 10 мл 96 % спирта этилового при перемешивании дополного растворения. Срок годности раствора не более 3 мес при хранении впрохладном, защищенном от света месте.Алюминия хлорида раствор 5 %. 5,0 г алюминия хлорида безводного или 9,0г алюминия хлорида 6-водного растворяют в 80 мл спирта этилового 70%,фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора темже спиртом до метки.
Срок годности раствора 3 мес.219Навеску 2,0 г измельчённого в ступке до кашицеобразного состояния сырьяпомещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 25мл спирта 70 %. Колбу присоединяют к обратному холодильнику, нагревают накипящей водяной бане в течение 45 минут, периодически встряхивают длясмывания частиц сырья со стенок. После охлаждения до комнатной температурыизвлечение фильтруют через бумажный фильтр. Затем полученное спиртовоеизвлечение упаривают на водяной бане, остаток высушивают в сушильном шкафупри 110 °С в течение 10 минут, затем добавляют 10 мл 15% серной кислоты,перемешивают до растворения осадка.
Полученный раствор помещают вконическую колбу, объемом 100 мл, присоединяют к обратному холодильнику,нагревают на кипящей водяной бане в течение 2 часов. После охлаждения докомнатной температуры полученное извлечение фильтруют через бумажныйфильтр. Осадок, оставшийся на фильтре, промывают водой очищенной,высушивают в сушильном шкафу при 110 °С в течение 10 минут и растворяют в 5мл горячего 96% этанола (испытуемый раствор).На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоемсиликагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером10 × 15 см наносят 20 мкл испытуемого раствора, рядом наносят 10 мкл растворастандартного образца СО кверцетина и СО изорамнетина. Пластинку снанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в камеру, предварительнонасыщенную в течение 1 ч смесью растворителей н-бутанол – уксусная кислоталедяная – вода (4:1:2), и хроматографируют восходящим способом.
Когда фронтрастворителя пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, еевынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, затемобрабатывают алюминия хлорида раствором 5 % в спирте 70 %, после чегопросматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.На хроматограмме раствора СО кверцетина должна обнаруживаться зонаадсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета, на хроматограмме раствора220СОизорамнетинатакжедолжнаобнаруживатьсязонаадсорбциисфлуоресценцией желто-зеленого цвета.Нахроматограммеиспытуемогорастворадолжныобнаруживатьсяследующие зоны адсорбции: зона адсорбции с флуоресценцией желто-зеленогоцвета на уровне зоны адсорбции на хроматограмме раствора СО кверцетина; зонаадсорбции с флуоресценцией желто-зеленого цвета на уровне зоны адсорбции нахроматограммераствораСОизорамнетина;допускаетсяобнаружениедополнительных зон адсорбции (флавоноиды).3.
Около 2,0 г измельчённого до кашицеобразного состояния помещают вконическую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 10 мл 2 %раствора серной кислоты, выдерживают в течение 40 мин на лабораторномвстряхивателе, затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр. 3 млполученного извлечения помещают в пробирку добавляют 3-5 капель 1% растворакремневольфрамовой кислоты. Появляется муть, переходящая в хлопьевидныйосадок (амариллисовые алкалоиды).4. Около 2,0 г измельченного в ступке до кашицеобразного состояния сырьяпомещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют10 мл спирта 70 %, нагревают с обратным холодильником на водяной бане втечение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры извлечениефильтруют через бумажный фильтр (испытуемый раствор).
К 5 мл извлеченияприбавляют 0,2 г порошка магния и 2 мл концентрированной кислотыхлористоводороднойразведенной;постепеннодолжноокрашивание (флавоноиды).ИСПЫТАНИЯВлажность. Не менее 75 %.Посторонние примесиОрганическая примесь. Не более 0,5 %.Минеральная примесь. Не более 1 %.появитьсярозовое221Тяжелые металлы. В соответствии с требованиями ОФС «Определениесодержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье илекарственных растительных препаратах».Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определениесодержаниярадионуклидоввлекарственномрастительномсырьеилекарственных растительных препаратах».Остаточные количества пестицидов.
Определение проводят согласно ОФС«Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительномсырье и лекарственных растительных препаратах».Микробиологическая чистота. Определение проводят согласно ОФС«Микробиологическая чистота».Количественное определение. Суммы амариллисовых алкалоидов впересчете на галантамин не менее 0,05 %.Сумма амариллисовых алкалоидовПриготовление растворовАцетата аммония раствор 20 Ммоль/л в воде. Около 1,542 г (точнаянавеска) ацетата аммония переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл,доводят водой для хроматографии до метки и перемешивают. При необходимостипроводят дегазацию и фильтрацию через мембранный фильтр с размером пор неболее 0,45 мкм.Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят100 мл ацетата аммония раствора 20 Ммоль/л в воде, добавляют 500 млацетонитрила и перемешивают, доводят объем колбы до метки ацетонитрилом иснова перемешивают.Приготовление стандартных растворов галантамина.
Около 20,0 мг(точная навеска) субстанции галантамина растворяют в мерной колбевместимостью 100 мл в ацетонитриле и доводят до метки тем же растворителем,получая стандартный раствор галантамина концентрацией 200 мкг/мл (растворА1). 10 мл раствора А1 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили объемколбы тем же растворителем до метки, получая раствор концентрацией 20 мкг/мл(раствор Б1).1 мл раствора А1 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводилиобъем колбы тем же растворителем до метки, получая раствор концентрацией 2мкг/мл (раствор В1).222Приготовление калибровочных растворов галантамина.Для приготовления калибровочных растворов с концентрацией растворагалантамина 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 25,0; 50,0 мкг/мл, проводят разбавлениестандартных растворов ацетонитрилом в соответствии с таблицей 1.Таблица 1.Приготовление калибровочных растворов галантаминаКонцентрацияКонцентрацияОбъемОбъемкалибровочногостандартногостандартногокалибровочногораствора, мкг/млраствора, мкг/млраствора, млраствора, мл2,5200,12515,0200,25110,0200,5115,0200,75125,02000,125150,02000,251Растворы хранят в плотно закрытой емкости в холодильнике не более 1 мес.Проверка пригодности хроматографической системы.Результаты анализа считаются достоверными, если выполняютсяследующие условия:1.
эффективность хроматографической колонки должна быть не менее 17 000теоретических тарелок для пика галантамина;2. коэффициент симметрии для пика галантамина должен быть не менее 0,8 и неболее 1,5.Аналитическую пробу сырья растирают в ступке до кашицеобразногосостояния. Около 10,0 г (точная навеска) сырья помещают в центрифужнуюпробирку объемом 50 мл, добавляют 10 мл метанола, экстрагируют вультразвуковой ванне при комнатной температуре (25 °С) в течение 40 мин.После пробирку центрифугируют при 3500 об/мин в течение 10 мин,надосадочную жидкость переносят в колбу объемом 100 мл, остаток смешивают сновой порцией экстрагента и повторяют операцию еще два раза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
