Диссертация (1141404), страница 23
Текст из файла (страница 23)
ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 290 нм) ГомЛРСG. nivalis. 1 – тацеттин; 2 –галантин; 3 – ликорин.154213 4Рис. 6.3.4. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 290 нм) НГМG. nivalis. 1 – марконин; 2 – гемантамин; 3 – 11-эпигемантамин; 4 –ликорин.6.4. Валидационные характеристики методикиВалидация методики количественного определения галантамина и ликоринас использованием метода ВЭЖХ с УФ-детектором выполнялась в соответствии снормами ГФ XIII, ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность ипрецизионность) методов и результатов измерений», а также стандартнымиоперационными процедурами (СОП) исследовательской организации.Валидация методики количественного определения суммы АА в пересчетена галантамин и ликорин проводилась по разделам: специфичность, линейность,предел обнаружения и предел количественного определения, правильность,повторяемость, точность, стабильность, устойчивость.6.4.1.
Химические реактивы и материалы• Стандартный образец (СО) галантамина (чистота >99%)• Стандартный образец (СО) ликорина (чистота >99%)• Вода деионизированная Milli-Q• Ацетонитрил HPLC-grade (Panreac Quımica, S.A., Barcelona, Spain)• Ацетат аммония, х.ч. Merck Laboratories (Darmstadt, Germany)1556.4.2. Оборудование и его параметры• жидкостной хроматограф Agilent 1260, оснащенный фотодиодно-матричнымдетектором, Agilent Technologies, США;• дозаторы переменного объема Eppendorf 100 – 1000 мкл и 1 – 5 мл, Германия;• система водоподготовки Millipore, Milli-Q Advantage A10, Франция.• колбы мерные класса «А» вместимостью 10, 50, 100 и 1000 мл.Валидация методики проводилась на высокоэффективном жидкостномхроматографе Agilent 1260, оснащенном градиентным насосом, обеспечивающимодновременную подачу 4-х растворителей, термостатом колонок и образцов,дегазатором, автосамплером и фотодиодноматричным детектором Agilent 1260Infinity Diode Array Detector (DAD).
Обработку данных проводили при помощиПО ChemStation for LC 3D systems (ver. B.04.03 [54]), Agilent Technologies, США.6.4.3. Условия хроматографического анализа и детектированиеОсновные характеристики метода представлены в таб. 6.4.3.1.Таблица 6.4.3.1.Параметры хроматографической системы и метода анализаПараметрЗначениеХроматографAgilent 1260 (Agilent Technologies, США)Неподвижная фазаХроматографическая колонка Poroshell 120 ECC18 Предколонка Poroshell 120 Fast Guard EC-C18Подвижная фазаЭлюированиеОбъём пробы, вводимойв хроматографТемпература термостатаколонкиВремя анализаацетонитрил: 20 Ммоль/л раствор ацетатааммония в воде деионизированной (90:10)Изократическое (скорость потока 0,8 мл/мин)20,0 мкл35 °С20 мин156Время удерживаниягалантаминаВремя удерживанияликоринаОколо 6,5 минОколо 17,5 минПрограммное обеспечениеChemStation (ver.
B.04.03 [54]), AgilentTechnologies, СШАДлина волны детектора290 нм6.4.4. Расчет содержания суммы амариллисовых алкалоидовРасчет содержания суммы АА проводят методом внешнего стандарта.Обсчету подлежат пик галантамина/ликорина, а также пики со спектрами,характерными для АА (максимумы поглощения при 235 и 290 нм).Содержание суммы АА в сырье в пересчете на галантамин/ликорин иабсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:·=·· 10· (100 −)где S − сумма площадей пиков галантамина/ликорина и других АА нахроматограмме испытуемого раствора;So − площадь пика на хроматограмме раствора СО галантамина/ликорина;– концентрация стандартного раствора, мкг/млm – масса навески сырья, мкг;W – влажность сырья, %.Содержание суммы АА в пересчете на галантамин/ликорин и абсолютносухое сырье в процентах (X), используя калибровочный график, вычисляют поформуле:=· 10· (100 −),где: С – содержание суммы АА в 1 мл испытуемого раствора, найденное покалибровочному графику, мкг;m – масса навески сырья, мкг;W – влажность сырья, %.157Содержание суммы АА в пересчете на галантамин/ликорин в НГМ впроцентах (X) вычисляют по формуле:·· 25,· · 10000=Где: S – сумма площадей пиков галантамина/ликорина и других АА нахроматограмме испытуемого раствора;So − площадь пика на хроматограмме раствора СО галантамина/ ликорина;– концентрация стандартного раствора, мкг/мла – аликвота настойки, мл;Содержание суммы АА в пересчете на галантамин/ликорин в НГМ впроцентах (X), используя калибровочный график, вычисляют по формуле:=· 25,· 10000где: С – содержание суммы АА в 1 мл испытуемого раствора, найденное покалибровочному графику, мкг;а – аликвота настойки, мл.6.4.5.
Приготовление стандартных растворов галантамина и ликорина20 мг субстанции галантамина растворяют в мерной колбе вместимостью100 мл в ацетонитриле и доводят до метки тем же растворителем, получаястандартный раствор галантамина концентрацией 200 мкг/мл (раствор А1). 10мл раствора А1 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили объем колбы темже растворителем до метки, получая раствор концентрацией 20 мкг/мл (растворБ1).1 мл раствора А1 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили объемколбы тем же растворителем до метки, получая раствор концентрацией 2 мкг/мл(раствор В1).20 мг субстанции ликорина растворяют в мерной колбе вместимостью 100мл в ацетонитриле и доводят до метки тем же растворителем, получаястандартный раствор ликорина концентрацией 200 мкг/мл (раствор А2).
10 млраствора А2 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили объем колбы тем жерастворителем до метки, получая раствор концентрацией 20 мкг/мл (раствор Б2). 1158мл раствора А2 помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили объем колбы темже растворителем до метки, получая раствор концентрацией 2 мкг/мл (растворВ2).6.4.6. Приготовление образцов контроля качества и калибровочных образцовДля приготовления образцов контроля качества и калибровочных образцовс концентрацией стандартного раствора галантамина 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0;10,0; 15,0; 25,0; 50,0 мкг/мл, и ликорина 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0; 10,0; 15,0;25,0; 50,0 мкг/мл проводили разбавление стандартных растворов ацетонитрилом всоответствии с таблицей 6.4.6.1.Таблица 6.4.6.1.Приготовление образцов контроля качества и калибровочных растворовКонцентрация вобразце контролякачества, мкг/млКонцентрациястандартного раствора,мкг/млГалантамин Ликорин Галантамин Ликорин0,10,122Объем стандартногораствора, млГалантамин0,05Ликорин0,05Объемобразцаконтролякачества,мл10,250,25220,1250,12510,50,5220,250,2511,01,0220,50,512,52,520200,1250,12515,05,020200,250,25110,010,020200,50,5115,015,020200,750,75125,025,02002000,1250,125150,050,02002000,250,2516.4.7.Параметрыпригодностихроматографическойсистемыиметрологические характеристики методикиПараметры пригодности хроматографической системы представлены втаблице 6.4.7.1.159Таблица 6.4.7.1.Параметры разделения АААлкалоидЛикоринtR, мин6,4Галантамин 17,3k’NαНГМ G.
woronowii143981,092,27,65173221,75RsAsSr2,630,890,3417,680,870,57ГомЛРС G. woronowiiЛикорин6,2Галантамин 16,52,1166851,092,810,880,537,25183572,6530,660,860,782,270,900,742,690,910,72НГМ G. nivalisЛикорин6,22,1145741,08ГомЛРС G. nivalisЛикорин6,32,15146561,09tR, мин – время удерживания; k’ – коэффициент емкости; N – число теоретическихтарелок; α – селективность; Rs – разрешающая способность, As - коэффициентассиметрии пика; Sr – относительное стандартное отклонение площадей пиков.Характеристики пиков АА представлены на рисунке 6.4.7.1.ω0,5=0,109h = 21,74S= 171,2As= 0,88ω0,5=0,290h = 5,68S= 111,6As= 0,87АВРис. 6.4.7.1.
Характеристика пиков ликорина и галантамина образцаконтроля качества (10 мкг/мл). ω0,5 – ширина пика в половине высоты, h – высота,S – площадь, As - коэффициент ассиметрии пика.160Нормативы параметров, которые предоставляют возможность оценитьприемлемость подобранных условий хроматографического разделения дляполучения объективных результатов, представлены в таблице 6.4.7.2. Полученныеэкспериментальныеданныесвидетельствуютосоответствиипоказателейхроматографической системы предъявленным требованиям.Таблица 6.4.7.2.Характеристика эффективности хроматографического разделенияПараметрНорма [51]Эффективность (число теоретических тарелок)Не менее 3 000Разрешающая способностьНе менее 1,5Коэффициент асимметрии пикаНе менее 0,8 и не более 1,5Относительное стандартное отклонениеНе более 2,0%Метрологические характеристики методики определения содержания суммыААвпересчетенагалантамин/ликоринвНГМ/ГомЛРСподснежниковпредставлена в таблице 6.4.7.3.Таблица 6.4.7.3.Метрологические характеристики методики количественного определения суммыАА в ГомЛРС/НГМ двух видов подснежников(n = 5, f = 4, P = 95%, T(f,P) = 2,7764)ОбъектSХΔXE,%Сумма АА в пересчете на галантаминНГМ G.
woronowii0,0111,9·10-70,000430,000190,0005 4,85ГомЛРС G. woronowii0,0554,3·10-70,000650,000290,0008 1,47Сумма АА в пересчете на ликоринНГМ G. nivalis0,0042 2,3·10-80,000150,000060,0002 4,44ГомЛРС G. nivalis0,0207,3·10-80,000270,000120,0003 1,67161Как видно из данных табл. 6.4.7.3., относительная ошибка единичногоопределения с 95 % доверительной вероятностью составляет от 1,47 до 4,85% и непревышает 5 %.6.4.8.
СпецифичностьМетодикахарактеристическиеопределениякомпонентыБАСявляетсядостоверноспецифичной,определяетсявеслиприсутствииимеющихся образце веществ. Чистота пиков идентифицированных АА былапоказана с помощью ДМД и МСД (см. раздел детектирование амариллисовыхалкалоидов). С помощью ДМД по специальной программе Peak Purity (в пакетеПО ChemStation) проверялась спектральная однородность пиков галантамина иликорина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
