Диссертация (1141404), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Чистота пиков представлена на рис. 6.4.8.1-6.4.8.3. Чем большезначение фактора чистоты пика (Pf – purity factor стремиться к 1000), тем большевероятность, того что пику соответствует одно соединение. Все анализируемыепики обладали Pf ˃999, что свидетельствует о высокой однородности пиков.Pf = 999,967Pf = 999,947ABРис.
6.4.8.1. Характеристика чистоты пиков ликорина (А) и галантамина (В) НГМG. woronowii. Pf (purity factor) – фактор чистоты пика.162Pf = 999,576Pf = 999,689ABРис. 6.4.8.2. Характеристика чистоты пиков ликорина (А) и галантамина (В)ГомЛРС G. woronowii. Pf (purity factor) – фактор чистоты пика.Pf = 999,524Pf = 999,727ABРис. 6.4.8.3. Характеристика чистоты пиков ликорина ГомЛРС (A) и НГМ (B) G.nivalis. Pf (purity factor) – фактор чистоты пика.6.4.9. ЛинейностьДля определения линейности методики в аналитическом диапазонеконцентраций 2,5-50,0 мкг/мл проводили анализ образцов контроля качества истроили график зависимости площади регистрируемых пиков ликорина (рис.6.4.9.1) и галантамина (рис. 6.4.9.2) от их концентрации в образцах.Для подтверждения линейности методики полученный коэффициенткорреляции калибровочной кривой должен быть больше 0,999.
Коэффициенткорреляции полученной калибровочной кривой составил 0,99992 для ликорина и0,99995 для галантамина и, что укладывается в критерий линейности.Хроматограмма образца контроля качества с концентрацией 2,5 мкг/мл ликоринаи галантамина представлен на рис. 6.4.9.3.163Рис. 6.4.9.1. Калибровочный график зависимости площади пика ликорина от егоконцентрации.Рис. 6.4.9.2. Калибровочный график зависимости площади пика галантамина отего концентрации.12Рис. 6.4.9.3. Хроматограмма образца контроля качества (2,5 мкг/мл). 1 – ликорин;2 – галантамин.1646.4.10. Относительный коэффициент чувствительности детектораБазовая линия при хроматографическом анализе практически принималавид прямой линии, уровень сигнал/шум не превышал значения 10:1 всоответствии с требованиями для предела количественного определенияинструментальных методик.6.4.11.
Предел обнаружения и количественного определенияДля оценки предела обнаружения (ПО) устанавливали минимальнуюконцентрацию определяемых веществ в образце, при которой величинаотношения аналитического сигнала к уровню шума составляет около 3:1. Пределобнаружения метода составил 0,25 мкг/мл.Для оценки предела количественного определения (ПКО) устанавливалиминимальную концентрацию определяемых веществ в образце, при которойвеличина отношения аналитического сигнала к уровню шума составляет около10:1.
Параллельно использовали данные, полученные в ходе анализа линейности,правильности и прецизионности методики для определения нижней границыаналитического диапазона. За ПКО методики принималась минимальнаяконцентрация галантамина и ликорина, для которой возможно определение созначениями RSD и ε не более 5%.
Предел количественного определения методикисоставил 0,5 мкг/мл для галантамина и 0,5 мкг/мл для ликорина.6.4.12. ПравильностьПравильностьметодикидоказываласьметодомдобавокСОликорина/галантамина к образцу контроля качества с известной концентрациейопределяемого вещества. Добавку проводили на уровнях 80, 100 и 120% отсодержания алкалоида в образце. Аналитическая методика воспроизводиласьтрижды для каждого уровня.
Результаты представлены в табл. 6.4.12.1.165Таблица 6.4.12.1.Правильность методикиСодержание Добавка, мкг НайденноеЗаданноев образце,содержание, содержание,мкг/млмкг/млмкг/млЛикорин15,012,026,927,012,027,327,012,026,527,015,031,530,015,029,630,015,030,130,018,032,833,018,034,033,018,032,333,0Статистические характеристикиСреднее значение,%Стандартное отклонение, %Коэффициент вариации (относительное стандартноеотклонение),%Доверительный интервал (Р=95%), %Галантамин15,012,027,127,012,028,227,012,026,727,015,029,730,015,030,430,015,031,330,018,033,333,018,032,733,018,032,833,0Статистические характеристикиСреднее значение,%Стандартное отклонение, %Коэффициент вариации (относительное стандартноеотклонение),%Доверительный интервал (Р=95%), %Отклик, %99,63101,1198,15105,0098,67100,3399,39103,0397,88Результат100,352,362,3598,53-102,17100,37104,4498,8999,00101,33104,33100,9199,0999,39Результат100,862,182,1699,18-102,541666.4.13.
Повторяемость и точностьДля оценки повторяемости методики в течение дня проводили анализ 3-хобразцов контроля качества с концентрацией галантамина 5,0 мкг/мл, 10,0 мкг/мл,25,0 мкг/мл и ликорина 5,0 мкг/мл, 10,0 мкг/мл, 25,0 мкг/мл. Каждый образецхроматографировали 5 раз.
Для полученных значений концентраций былирассчитаны величины относительного стандартного отклонения (RSD, %),характеризующие повторяемость методики и относительной погрешностиединичного определения (ε, %), характеризующие точность методики. Значенияотносительного стандартного отклонения не превышали 5%, что говорит оповторяемости методики. Значения относительной погрешности единичногоопределения не превышали 5%, что говорит о точности методики. Данныепредставлены в таб. 6.4.13.1.Таблица 6.4.13.1.Повторяемость и точность методики (n=5)Введено(мкг/мл)5,010,025,0Найдено(мкг/мл)5,215,175,155,185,1910,4510,3810,2110,1910,3724,8425,2824,9125,1625,18НайденоSD, %(мкг/мл),среднеезначениеГалантаминRSD, %E,%5,180,0220,433,610,320,1141,103,225,070,1890,750,28167Ликорин5,115,145,085,195,159,879,799,689,809,7525,2225,1725,1224,8824,915,010,025,05,130,0420,812,69,780,0700,71-2,225,060,1550,620,24SD – стандартное отклонениеRSD – коэффициент вариации (относительное стандартное отклонение)ε – относительной погрешности единичного определения6.4.14.
Аналитическая область методикиАналитическаяобластьданнойметодикисучетомрезультатовисследования линейности, точности и повторяемости составляет 2,5-50,0 мкг/млдля галантамина и 2,5-50,0 мкг/мл для ликорина.6.4.15. СтабильностьСтабильность стандартного раствораСтабильностьхроматографическогостандартногоисследованиярастворапослеоценивалиразведениядопутёмегоконцентраций,соответствующих концентрациям образцов контроля качества; указанноеразведение учитывали в дальнейшем при расчёте концентраций.
Оценивалистабильность в течение 1 недели, анализируя раствор на начало и окончаниеуказанногопериода.Исследовалипо3независимыхобразцовкаждойконцентрации. Стандартный раствор галантамина и ликорина были стабильныпри хранении в течение не менее 1 недели.168Стабильность испытуемого образцаСтабильность испытуемого образца оценивали путём хроматографическогоисследования трёх образцов контроля качества различной концентрации.Половину образцов анализировали сразу после приготовления, а остальные –после хранения в замороженном состоянии в течение 3 недель. Исследовали по 3независимых образца каждой концентрации.
Галантамин и ликорин былистабильны в составе испытуемого раствора при хранении в замороженномсостоянии в течение не менее 3 недель.6.4.16. УстойчивостьУстойчивость, или робастность, системы испытывали при незначительномизменении параметров методики количественного определения. В экспериментеизменяли длину волны детектора и скорость потока подвижной фазы, таб.6.4.16.1. Критерии допуска коэффициент вариации ≤3% выполнен. Устойчивостьметода удовлетворительная.Таблица 6.4.16.1.Устойчивость методикиДлинаволны,нмСкоростьпотока,мл/минСреднее процентное содержание алкалоида виспытуемом растворе, от заданного количестваСреднеезначение, %Галантамин2890,65101,20,7598,82910,6599,30,7598,9Средняя величина, xсрСтандартное отклонение, SDОтносительное стандартное отклонение, RSDКоэффициент вариацииЛикорин2890,65101,60,75100,42910,6598,70,7599,1Средняя величина, xсрСтандартное отклонение, SDОтносительное стандартное отклонение, RSDКоэффициент вариации100,0099,199,551,1210,5611,13101,0098,9099,951,3180,6591,32169ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 61.
Оптимизированы условия разделения амариллисовых алкалоидов вусловиях хроматографии гидрофильных взаимодействий на колонке С18 споверхностно-пористым сорбентом (непривитым силикагелем) с использованиемизократического элюирования ПФ, представляющей собой смесь ацетонитрила с20 Ммоль/л водного раствора ацетата аммония в соотношении 9:1.2. Разработана ВЭЖХ-методика с УФ-детектированием для идентификациии количественного определения амариллисовых алкалоидов в ГомЛРС и НГМподснежников Воронова и белоснежного.
Аналитическая область даннойметодики составляет 2,5-50,0 мкг/мл для галантамина и 2,5-50,0 мкг/мл дляликорина. Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительнойвероятностью составляет от 1,47 до 4,85% и не превышает 5 %.3. Методика успешно прошла валидационные испытания по параметрам:специфичность, линейность, предел обнаружения и предел количественногоопределения, правильность, повторяемость, точность, стабильность, устойчивостьи может быть использована для количественного определения амариллисовыхалкалоидов в ГомЛРС и НГМ двух видов подснежников.170ГЛАВА 7. РАЗРАБОТКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВАГОМЕОПАТИЧЕСКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГОРАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И НАСТОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХМАТРИЧНЫХ ПОДСНЕЖНИКОВ ВОРОНОВА ИБЕЛОСНЕЖНОГОПри установлении подлинности ГомЛРС общепринятым является анализ поразделам: внешние признаки, микроскопия, определение основных групп БАС(качественные реакции и ТСХ).
На основании изучения ГомЛРС двух видовподснежников установлены характерные внешние и микроскопические признаки,предложены качественные реакции и ТСХ на АА и флавоноиды, изложенные вПриложениях 3,5. Подлинность НГМ устанавливается качественными реакциями,методом ТСХ и по УФ-спектру [19]. Методики ТСХ анализа, качественныереакции, а также данные УФ-спектров НГМ, изложены в Приложениях 4,6.7.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
