Диссертация (1141404), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Суммарное содержание производных ГКК кислот в НГМ подснежникаВоронова составило 6,44±0,51 мг/100 мл, а в НГМ подснежника белоснежного3,17±0,25мг/100мл.ВНГМподснежникаВороноваобнаруженынеохлорогеновая (3,78±0,30 мг/100 мл), хлорогеновая (1,80±0,14 мг/100 мл) икриптохлорогеновая (0,86±0,07 мг/100 мл) кислоты. В НГМ подснежника147белоснежного были обнаружены хлорогеновая (3,04±0,24 мг/100 мл) икриптохлорогеновая (0,13±0,01 мг/100 мл) кислоты.5.
Содержание ОК в НГМ подснежника Воронова составило 86,84±1,74мг/100 мл, а в НГМ подснежника белоснежного 124,89±1,79 мг/100 мл.Основными обнаруженными ОК НГМ подснежников Воронова и белоснежногоявлялись соответственно: янтарная (61,19±0,81 и 64,25±0,85 мг/100 мл), яблочная(22,71±0,74 и 32,17±0,68 мг/100 мл) и щавелевая (2,94±0,19 и 28,47±0,26 мг/100мл) кислоты.6. Изучен аминокислотный состав НГМ подснежников Воронова ибелоснежного. Установлено наличие 20 аминокислот, в том числе 8 незаменимых,общее содержание аминокислот составило 0,204% и 0,20 в НГМ подснежниковВоронова и белоснежного соответственно. В наибольшем количестве содержатсязаменимые аминокислоты: аспартат (0,071% и 0,044%), глутамат (0,050% и0,033%) и аргинин (0,017 и 0,031%).7.
Методами ВЭЖХ-РМД, ВЭЖХ-УФ установлено, что количественноесодержание свободных углеводов (глюкозы, фруктозы, сахарозы) и связанных(глюкозы, галактозы, арабинозы, ксилозы, маннозы) в НГМ подснежникаВоронова составило 0,051% и 0,191%, а в НГМ подснежника белоснежного –0,063% и 0,163% соответственно. Содержание полисахаридов в НГМ G. woronowiiсоставило 0,231±0,011, а в НГМ G.nivalis – 0,282±0,014.8. Методом зонального КЭ определено содержание катионов в НГМ:подснежника Воронова – K+ (828,3 ppm) ˃ Na+ (67,3 ppm) ˃ Al3+ (65,4 ppm) ˃ Mg2+(43,4 ppm) ˃ Ca2+ (21,4 ppm); подснежника белоснежного – K+ (867,3 ppm) ˃ Mg2+(69,6 ppm) ˃ Na+ (53,5 ppm) ˃ Al3+ (27,4 ppm) ˃ Ca2+ (26,2 ppm).
Содержаниетяжелых металлов и мышьяка в исследуемых НГМ двух видов подснежниковсоответствует требованиям действующей нормативной документации.148ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ ВЭЖХ-УФ МЕТОДАКОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМАРИЛЛИСОВЫХАЛКАЛОИДОВПолитературнымданнымподснежникинакапливаютзначительноеколичество АА, локализующихся в клеточном соке в виде солей с органическимикислотами вместе с другими БАС (флавоноидами, ГКК и др.). Комплекс БАСпереходит в НГМ – экстракционную лекарственную форму, разрешенную длямедицинскогоприменения.ОсновнойгруппойБАСобеспечивающейтерапевтическое действие подснежников являются АА. Исходя из этого, намиразработаны ВЭЖХ-УФ методики определения АА в ГомЛРС и НГМ двух видовподснежников для включения в соответствующие проекты ФС.6.1.
Пробоподготовка образцов для анализаДля извлечения АА из ГомЛРС подснежников нами применяласьтрехкратная экстракция метанолом при воздействии ультразвуком. В полученномнативном экстракте АА переводили в солевую форму путем добавления растворасоляной кислоты. Очистку от липофильной фракции проводили диэтиловымэфиром. Затем полученный раствор подщелачивали, амариллисовые алкалоиды вформеоснованийреэкстрагировалихлороформом,получалиочищенныйалкалоидный экстракт.Пробоподготовка ГомЛРСНавеску массой 10,0 г ГомЛРС подснежника, растёртого в ступке докашицеобразного состояния, помещают в центрифужную пробирку объемом 50мл, экстрагируют 3 раза метанолом (10 мл) в ультразвуковой ванне прикомнатной температуре (25 °С) в течение 40 мин. После каждого этапаэкстракции пробирку центрифугируют при 3500 об/мин в течение 10 мин,надосадочную жидкость переносят в колбу объемом 100 мл.
Растворительупаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при 60 °С, полученныйсухой остаток растворяют в 15 мл 5%-ной соляной кислоты. К полученному149раствору добавляют 15 мл диэтилового эфира, встряхивают в течение 10 мин налабораторном шейкере, верхний эфирный слой отбрасывают, экстракциюповторяют трижды. Водную фазу подщелачивают, добавляя 10% раствор аммиакадо рН 9, затем проводят трехкратную экстракцию по 20 мл хлороформа.Хлороформные экстракты объединяют, добавляют 10 г безводного сульфатанатрия, перемешивают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.Органический растворитель удаляют на вакуумном ротационном испарителе при60 °С. Полученный экстракт растворяют в 10 мл подвижной фазы.Пробоподготовка НГМ1,5 мл настойки переносят в мерную колбу, вместимостью 25 мл, доводятобъем до метки подвижной фазой. 2 мл полученного раствора центрифугируют втечение 5 мин при 4500 об/мин.
1 мл надосадочной жидкости помещают в виалыдля хроматографирования и используют для анализа.6.2. Детектирование амариллисовых алкалоидов в извлечениях из ГомЛРС иНГМИдентификация АА проводилась методом ВЭЖХ-УФ в сочетании с массспектрометрическим детектированием с ионизацией электрораспылением.Детектирование АА проводили с использованием системы ВЭЖХ/УФ/МС,состоящей из:1) жидкостного хроматографа Agilent 1100 Series (Agilent Technologies,США), в состав которого входил: дегазатор, насос, обеспечивающий одновременную подачу 2-х растворителей, автосемплер с термостатом, термостатхроматографических колонок, диодно-матричный детектор (ДМД) Agilent 1100Series Diode Array Detector (DAD) и ПО для обработки хроматографическихданных ChemStation версии B.01.03 SR 1 (204).2) системы LC/MSD Trap SL с масс-селективным детектором (МСД) 1946А(Agilent Technologies, США) под управлением ПО MSD Trap Control Version 5.3(Build 11) от Bruker Daltonic Inc.
(Bruker, Германия).150ПрименяласьколонкаОФ-ВЭЖХдлярежимахроматографиигидрофильных взаимодействий – Poroshell 120 EC-C18, 2,7 мкм, 4,6 × 150 мм(Agilent Technologies, США) с поверхностно-пористым сорбентом (непривитымсиликагелем). Масс-спектрометр типа «ионная ловушка» был оснащен внешнимисточником ионов с ионизацией электрораспылением при атмосферном давлении(API/ESI). Напряжение на капилляре и противоэлектроде (конусе) составляло –3,5 кВ и 500 В соответственно; скорость потока осушающего газа азота – 12л/мин; температура в камере ионизации – 350 °C.
Давление на распылителе – 4,08атм. Сканирование по полному ионному току проводили в диапазоне 100-700а.е.м. Скорость подачи элюента (изократический режим) – 0,8 мл/мин.Температура термостата колонки – 35 °C. Время регистрации хроматограммы – 20мин. Объем вводимой пробы – 20 мкл.АА имеют схожие спектры поглощения в УФ- области с максимумами вдиапазоне 285-295 нм. Спектр поглощения ликорина и галантамина представленна рис. 6.2.1.
В дальнейших исследованиях детектирование осуществляли придлине волны 290 нм.АВРис.6.2.1. УФ-спектры ликорина (А) и галантамина (В).Структуры АА подтверждались на основании данных МС-анализа.Исследование масс-спектров позволило провести идентификацию основных ААдвух видов подснежников, содержащихся в ГомЛРС и НГМ. Полученные данныеи максимумы поглощения в УФ-области спектра представлены в таблице 6.2.1.151Таблица 6.2.1.Максимумы поглощения и результаты МС анализа основных АААлкалоидУФλmax(нм)6-Oметилпретацеттинштернбергинизомер галантинагалантинликоринликорамингалантамин290290290290290290290тацеттингалантинликорингалантамин290290290290марконингемантамин11эпигемантаминликорин290290290тацеттингалантинликорин290290290290MrДетектируемый ДетектируемаяионмассаНГМ G. woronowii345[M+H]+346,3331[M+H]+317[M+H]+317[M+H]+287,3[M+H]+289[M+H]+287,3[M+H]+ГомЛРС G.
woronowii331[M+H]+317[M+H]+287,3[M+H]+287,3[M+H]+НГМ G. nivalis329[M+H]+301[M+H]+301[M+H]+330,3302,3302,3[M+H]+288,2[M+H]+[M+H]+[M+H]+332,3318,3288,3287,3ГомЛРС G. nivalis331317287,3332,3318,3318,3288,2290,3288,3332,3318,3288,2288,36.3. Поиск оптимальных условий для эффективного хроматографическогоразделения амариллисовых алкалоидовПоскольку АА сильнополярные соединения для их анализа можетприменяться нормально-фазовая гидрофильная хроматографическая система(хроматография гидрофильных взаимодействий, HILIC).
Подобраны оптимальныеусловия разделения на колонке С18 с поверхностно-пористым сорбентом(непривитым силикагелем). В качестве ПФ опробованы смеси ацетонитрила с 20152Ммоль/л водным раствором ацетата аммония в различных соотношениях (7:3; 8:2;9:1)длядостиженияразделенияблизкихпоструктуреамариллисовыхалкалоидов. Элюирование проводилось в изократическом режиме, посколькуизменение в составе подвижной фазы приводило к значительному увеличениювремени кондиционирования колонки после анализа и большим временнымзатратам. Скорость расхода ПФ также варьировалась от 0,5 и 1,0 мл/мин.
Самыелучшие параметры, характеризующие хроматографическое разделение АА, былиполучены при использовании изократического элюирования ацетонитрилом и 20Ммоль/л водным раствором ацетата аммония в соотношении 9:1, и расходеэлюента 0,8 мл/мин. Общее время анализа составило 20 мин.Хроматограммы извлечения из ГомЛРС и НГМ двух видов подснежниковпредставлены на рис. 6.3.1-6.3.4.12 34Рис.6.3.1.
ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 290 нм) извлечения ГомЛРСG. woronowii. 1 – тацеттин; 2 – галантин; 3 – ликорин; 4 – галантамин.1534531267Рис. 6.3.2. ВЭЖХ хроматограмма (ДМД, длина волны 290 нм) НГМG. woronowii. 1 – 6-O-метилпретацеттин; 2 – штернбергин; 3 – изомер галантина;4 – галантин; 5 – ликорин; 6 – ликорамин; 7 – галантамин.123Рис. 6.3.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
