Диссертация (1141404), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Гидролизпроводился на кипящей водяной бане при 100 °C в течение 2,5 часов. Полученныйраствор центрифугировали в течение 15 мин при 4500 об/мин. Отбирали 0,5 млнадосадочной жидкости, прибавляли 1,5 мл воды очищенной. Затем 2 мл растворапропускали сквозь концентрирующий патрон Диапак C16 (ЗАО БиоХимМак СТ,РФ) с обращенной фазой, отбрасывая первые 1,8 мл и собирая последующие 0,2мл, который переносили в виалы для хроматографирования и использовали дляанализа.Для количественного определения полисахаридов использовалась методика,приведенная в ГФ XIII, ФС.2.5.0032.15 Подорожника большого листья.2.2.7.
Определение элементного составаЭлементныйсоставГомЛРСподснежниковопределялсяметодомрентгенофлуоресцентного анализа (РФА).Пробоподготовка. Предварительно высушенное ГомЛРС подснежниковизмельчали в агатовой ступке, просеивали через сито с размером ячеек 200 мкм,затемпрессовали излучатель. Излучателипредставлялисобойтаблетки,спрессованные из навески массой 0,5 г тонко измельченного ГомЛРСподснежника на подложке из кислоты борной.Измерение аналитических линий ХЭ – Na, Mg, Al, Si, P, S, Cl, K, Ca, Ti, Cr,Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Rb, Sr, Zr, Ba, Pb – проводили с использованиемрентгеновского спектрометра S4 Pioneer (Bruker, Германия).
Режим работырентгеновской трубки керамической с родиевым анодом: напряжение 30 и 50 кВ,различная сила тока I (в зависимости от определяемого ХЭ). При определении ХЭ59в ряде Na-К I= 60 мА, а напряжение на трубке – 30 кВ; для ХЭ ряда Ca-Pb - 40 мА,50 кВ.
В зависимости от содержания ХЭ изменялось время набора импульсов – от10 до 100 сек. Для каждого ХЭ были подобраны оптимальные условия измерения.Оптимизировались следующие параметры: тип регистрирующего устройства,кристалл-анализатор, время набора импульсов. Построение градуировочнойзависимости проводилось с использованием отечественных и зарубежных СО.Использовались следующие СО: ГСО – 3169-85 клубни картофеля (CMБK-02),3171-85 зёрна пшеницы (CБMП-02), 8922-2007 луговая травосмесь (Tp-1), 89212007 элодея канадская (EK-1), 8923-2007 лист берёзы (ЛБ-1); зарубежные СО –GВW 07605 листья чая, GВW 07603 ветки тополя, GВW 07604 листья тополя.Расчетпределовобнаруженияпроводилсяпо3σ-критерию,учитываяпогрешность измерения фона непосредственно рядом с линией.
Контрольправильности результатов анализа проводился с помощью польского СО INCTMPH-2 травосмеси.Пробоподготовку и определение тяжелых металлов (Pb, Cd, Hg) и мышьякапроводили в соответствии с ОФС.1.5.3.0009.15 «Определение содержаниятяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье илекарственных растительных препаратах» [51], а также с руководством Р4.1.1672-03[89].Измеренияпроводилинаспектрофотометреатомно-абсорбционном Z 5300 (Hitachi, Япония).Для анализа катионов НГМ применялся метод зонального капиллярногоэлектрофореза (КЭ) [72, 73] на универсальной системе КЭ Agilent 3D-CE (США),снабженной диодно-матричным детектором (режим scan в диапазоне 190-600 нм).Кварцевый капилляр – Agilent G1600-61232 (увеличенный оптический путь,Lэффективная/Lобщая=56/64,5 см, внутренний диаметр (ID) 50 мкм.
Обработка данныхпроводилась с использованием ПО 3D-СЕ ChemStation Rev. В.04.03 (16).Величина тока – 0-300 мкА, величина мощности – 0-6 Вт, диапазон напряженийсоставлял от 0 до + 30 кВ, электрокинетическое и гидродинамическое введениепробы, ID капилляров – 50, 75 и 100 мкм, термостатирование капилляра при 25ºС.Приготовление рабочего буферного раствора: 136 мг имидазола (навеска с60точностью до 1 мг), 8,5 мг 18-краун-6 эфира вносили в мерную колбу,вместимостью 100 мл, добавляли около 60 мл воды, перемешивали до полногорастворения, доводили pH до 3,6 кислотой муравьиной, затем доводили объемводой до метки, полученный раствор перемешивали. Ввод пробы: гидродинамический в течение 4 секунд при давлении 50 мбар.
Напряжение: 25 кВ.Детектирование проводилось на длине волны 210 нм, длина волны сравнения –350 нм. Пробоподготовка: 2 мл НГМ помещали в мерную колбу, вместимостью 10мл, прибавляли 200 мкл раствора ацетата лития (внутренний стандарт,содержание ионов лития 0,05 %), затем доводили водой до метки, перемешивали.2.2.8. Определение биологической активностиВ экспериментах использовали следующие клеточные культуры: Hela(аденокарцинома шейки матки человека) и Fet MSC (мезенхимальные стволовыеклетки из костного мозга человеческого эмбриона).
Выращивание клеточныхкультур проводили в следующих условиях: температура +37 °C, атмосфера с 5%СО2, среда DMEM для культур клеток (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium),содержащая 10% эмбриональную телячью сыворотку крови (PAA Laboratories).Цитотоксические эффекты АА (МТТ-тест). Для исследований клеткивносили в культуральные 24-луночные планшеты (15000 клеток в 1 лунку) и через24 ч после посева в инкубационную среду вносили исследуемые растворы(ликорин 1 мг/мл, галантамин 1 мг/мл, настойки и их разведения). Через 48 чпосле добавления растворов в среду добавляли МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]2,5-дифенил-2H-тетразолиум бромид) до конечной концентрации 0,25-0,5 мг/мл,затем клеточные культуры инкубировали в течение 4 ч при температуре +37 °C ватмосфере с 5% СО2.
В конце инкубации окрашенную культуральную средуотбирали,ирастворялиобразовавшиесякристаллыМТТ-формазанавподкисленном 50% изопропаноле (0,05н HCl). Концентрацию формазана,образованногоживымиклетками,оценивалиспектрофотометрическипоинтенсивности окраски полученных растворов, оптическую плотность измеряли61приλ=570нм.Интенсивностьокраски,соответствующаяконцентрацииформазана у необработанных клеток, принималась за 100%.2.3. Реактивы и стандартные образцыВ настоящей работе использовались растворители и реактивы, отвечающиевсем требованиям соответствующей НД [51].
В ходе проведения аналитическихисследований (ТСХ-, СФМ- ВЭЖХ- анализы) по определению индивидуальныхБАСвкачествеСОиспользовалиськоммерческидоступныеобразцыиндивидуальных веществ, которые приведены в таблице 2.3.1.Таблица 2.3.1.Стандартные образцы индивидуальных веществНаименованиеЧистота CAS №АлкалоидыФирма-производительГалантаминЛикорин≥ 98%≥ 98%Nanjing Spring & AutumnBiological Engineering Co., Ltd(NSABE), Jiang Su, China357-70-0476-28-8ФлавоноидыКверцетинГиперозидКемпферол≥ 99,5%≥ 98,5%≥ 96,0%117-39-5482-36-0482-36-0ООО «Фитопанацея»ООО «Фитопанацея»FlukaГидроксикоричные кислотыНеохлорогеновая кислотаХлорогеновая кислотаКриптохлорогеновая кислота≥95,0%≥ 95,0%≥ 95,0%906-33-2327-97-9905-99-7Sigma-AldrichSigma-AldrichSigma-AldrichОрганические кислотыЩавелевая кислотаЯблочная кислотаЯнтарная кислота≥ 98,0%≥ 99,0%≥ 99,5%6153-56-66915-15-7110-15-6FlukaSigma-AldrichFlukaУглеводыГлюкозаГалактозаФруктозаСахарозаАрабиноза≥ 99,5%≥ 99,0%≥ 99,0%≥ 99,5%≥ 99,0%МаннозаКсилоза≥ 99,5%≥ 99,0%50-99-759-23-457-48-757-50-128697-5323458-28-458-86-6FlukaSigma-AldrichSigma-AldrichSigma-AldrichSigma-AldrichSigma-AldrichSigma-AldrichАминокислотыСтандартная смесь аминокислот≥ 99,0%-Sigma-Aldrich622.4.
Валидация методов, обработка полученных результатовВалидацию методов определения групп БАС проводили согласно ГФ XIIIизд., в. 1, с.222. «Валидация аналитических методик» (ОФС.1.1.0012.15).Статистическуюобработкурезультатовисследованийпроводиливсоответствии с требованиями ГФ XIII изд., в. 1, с.235. «Статистическая обработкарезультатов химического эксперимента» (ОФС.1.1.0013.15) [51], для обработкиданных использовался пакет ПО Microsoft Office Excel 2010. Метрологическиехарактеристики методик анализа представлены в виде таб.
2.4.1.Таблица 2.4.1.Метрологические характеристики методики определения БАС в ГомЛРС/НГМдвух видов подснежников (n =5, Px = 0,95, t(p,f)=2,776)S2x,%ОбъектSxΔxГомЛРС, НГМ G. woronowiiГомЛРС, НГМ G. nivalisn – число повторных испытаний;– среднее значение из числа повторностей,=∑ ·;Px – доверительная вероятность;t (P, f) – критерий Стьюдента;S2x – дисперсия;Sx – стандартное отклонение,=̅∑ ·();– стандартное отклонение среднего результата,Δx – доверительный интервал,=( , )·√̅=;̅ – относительная ошибка определения, ̅ =· 100%√;,%63ГЛАВА 3. МАКРОСКОПИЧЕСКИЙ И МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗГОМЕОПАТИЧЕСКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯПОДСНЕЖНИКОВ ВОРОНОВА И БЕЛОСНЕЖНОГО3.1.
Изучение внешних признаков сырья подснежниковХарактеристика свежего цельного сырья G. woronowii (рис. 3.1.1)представлена в Приложении 3 и в работе [130].Рис. 3.1.1. Внешний вид ГомЛРС G. woronowii.Характеристика свежего цельного сырья G. nivalis (рис. 3.1.2) представленав Приложении 5 и в работе [130].Сравнительная характеристика внешних признаков ГомЛРС подснежниковВоронова и белоснежного представлена в таб. 3.1.1.64Рис. 3.1.2. Внешний вид ГомЛРС G. nivalis.Таблица 3.1.1.Сравнение внешних признаков ГомЛРС G. woronowii и G. nivalisПризнакСтроение иразмерыФормаРасположениеВерхушка,основание ивлагалище листаКрай листаЖилкование листаОпушениеНаличие восковогоналетаЦветЦветФормаХарактерповерхностиG.
woronowiiЛистьяПростое, ширина листа 1,5-2,5см, длина листа 15-23 смШироколанцетнаяВ почке один лист обхватываетдругойЗаостренные, суживающиеся уоснования и постепеннопереходящие во влагалища,длиной 3,5-6,0 смЦельныйПараллельноеОтсутствуетОтсутствуетЯрко-зелёный с желтоватымоттенком, поверхностьблестящаяЦветоносЗелёныйЦилиндрическийРебристыйG.
nivalisПростое, длина листа 8-12 см,ширина листа 0,4-0,5 смЛинейнаяВ почке примыкают друг к другуплоскоТуповатые, немногосуживающиеся у основания ипостепенно переходящие вовлагалища, длиной 2,0-4,0 смЦельныйПараллельноеОтсутствуетС восковым налётомТёмно-зелёный или сизый,поверхность матоваяЗелёныйЦилиндрическийСлаборебристый65ОпушениеРазмерыГолыйДлиной 9-15 см, толщиной до2,5 ммЦветокПростой венчиковидныйГолыйДлиной 7-10 см, толщиной до 1,5ммАктиноморфныйЛинейный, пленчатый, длиной до2 смДлиной 2,5 см3наружныхлисточкаоколоцветникапродолговатообратнояйцевиднойформы,длиной 1,8 см, шириной 0,6 см; 3внутреннихлисточкаоколоцветника длиной 1,0 см,шириной 0,4 см, клиновиднойформы, плоские, наверху свыемкойикрупнымподковообразнымзелёнымпятном размером 1 мм.ФормаАктиноморфныйЛинейный, пленчатый, длинойдо 4 смДлиной 4,5 см3наружныхлисточкаоколоцветникаобратнояйцевидные,слабовогнутые длиной 2,3 смшириной 1,3 см; 3 внутреннихлисточкаоколоцветникашириной 0,8 см, длиной 1,2 см,книзу клиновидно суженные,плоские, прямостоячие, наверхусвыемкойикрупнымподковообразнымзелёнымпятном размером 1,6 мм6накороткихнитях,прикрепленных к основаниюоколоцветника, длиной 0,6 см,пыльники с остроконечиями1Завязь нижняя, 3-х гнёздная,продолговатая, длиной 0,3-0,4см, столбик нитевидный сострым рыльцемСлабый специфическийВкус не определяется (сырьеядовито)ЛуковицаГрушевиднаяРазмерДлина 3,0 см, диаметр 2,5 смДлина 2,0 см, диаметр 1,5 смНаружнаяповерхностьСлегка морщинистая, покрытажёлто-коричневыми кожистымичешуямиБелыйСлегка морщинистая, покрытасветло-коричневыми кожистымичешуямиБелыйСтупенчатоеНа одном уровнеКорниЦилиндрическая, шнуровиднаяДлиной до 25 см, в диаметре до2 ммБелыйЦилиндрическая, нитевиднаяДлиной до 15 см, в диаметре до 1ммБелыйСтроениеоколоцветникаСтроение венчикаПрицветникЦветоножкаЧисло и формалепестковЧисло и строениетычинокЧисло пестиковОсобенностистроения завязиЗапах ГомЛРСВкус ГомЛРСЦвет, без кроющихчешуйРасположениенаружных чешуйФормаРазмерыЦветПростой венчиковидный6накороткихнитях,прикрепленныхк основаниюоколоцветника, длиной 0,5 см,пыльники с остроконечиями1Завязь нижняя, 3-х гнёздная,округлая в диаметре длиной 0,10,2 см, столбик нитевидный сострым рыльцемСлабый специфическийВкус не определяется (сырьеядовито)Грушевидная или коническая663.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
