Диссертация (1141404), страница 10
Текст из файла (страница 10)
10 мл НГМ подснежника упаривали досуха навакуумном ротационном испарителе, полученный сухой остаток растворяли в 10мл 5% -ной соляной кислоты, а затем сопутствующие липофильные соединенияудаляли с диэтиловым эфиром (3 × 15 мл). Водную фазу подщелачивали путемдобавления 10% раствора аммиака до рН 9, затем алкалоиды экстрагировалихлороформом (3 × 15 мл). Хлороформные экстракты объединяли, добавляли 10 гбезводного сульфата натрия, перемешивали и фильтровали через складчатыйбумажныйфильтр.Органическийрастворительудалялинавакуумномротационном испарителе.
Полученный алкалоидный экстракт растворяли в 1 млметанола и подвергали анализу ГХ-МС.Масс-спектрометр работал в режиме электронного удара (EI) при 70 эВ,диапазон сканирования от 40 до 400 m/z (массы характеристических ионовамариллисовых алкалоидов находятся в указанном диапазоне). Температурнаяпрограмма хроматографирования – изотерма 1 мин при 80 °С, линейный нагрев от80 до 220 °С со скоростью 30 °С в мин и изотерма 1 мин при температуре 220 °С,линейный нагрев от 220 до 280 °С со скоростью 5 °С в мин и изотерма 30 мин при280 °С. Температура испарителя – 280 °С. Скорость потока газа-носителя (гелия)составляла 2 мл в мин.
Режим ввода – Split 1:30. Объем вводимой пробы 1 мкл.АА определяли путем сравнения масс-спектра соединения со стандартнымиэталонными спектрами из базы данных NIST 05 (NIST Mass Spectral Database, ver.5.0). Относительное содержание каждого соединения в алкалоидной фракциибыло рассчитано как отношение площади пика индивидуального соединения ксумме площадей пиков всех идентифицированных алкалоидов (100% метод)[129].53Количественное определение суммы АА методом СФМ. Для определениясодержания суммы АА в ГомЛРС и НГМ G. woronowii и G.
nivalis применяласьэкстракционно-спектрофотометрическая методика, основанная на избирательномвзаимодействии АА изохинолинового ряда с 1 % раствором тропеолина 000-II,подкисленногосолянойкислотой;образующийсякомплексизбирательноэкстрагируется в хлороформ (органическую фазу), затем проводят измерениеоптической плотности.
В тех же условиях параллельно проводились аналогичныеиспытания с СО галантамина и ликорина [19, 25, 37].УФ-спектры снимали на приборе «Cary 50 Scan» фирмы AgilentTechnologies (ранее – Varian, США) с ПО «Cary WinUV Analysis Pack ver. 3.1» для«Windows». Расчет количественного содержания суммы АА проводился впересчете на галантамин-основание и ликорин-основание.2.2.2.Определение флавоноидовОпределениефлавоноидовпроводилиметодомультраэффективнойжидкостной хроматографии (УЭЖХ) с масс-селективным и УФ-детектированием. Более подробно условия представлены в работах [32, 36].Пробоподготовка.ИзвлечениефлавоноидовизГомЛРСпроводилиэкстракцией 70% этиловым спиртом [36]. 2 мл НГМ/извлечения из ГомЛРС центрифугировали в течение 5 мин при 4500 об/мин.
1,5 мл надосадочной жидкостипомещали в виалы для хроматографирования и использовали для анализа [32].Оценка количественного содержания агликонов флавоноидов проводиласьпослегидролизаметодомВЭЖХ-УФсогласнометодике«Определениефлавонологликозидов гинкго билоба» [104]. ТСХ-анализ выполнялся согласнометодике определения флавоноидов в листьях осины обыкновенной [71].2.2.3. Определение гидроксикоричных кислотОпределение ГКК проводили методом ОФ ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием при длине волны 330 нм в режиме градиентного элюирования. Содержание ГКК определяли в пересчете на соответствующий стандарт.Пробоподготовка ГомЛРС.
Двукратную экстракцию ГКК из сырьяподснежников (2,0 г.), измельченного до кашицеобразного состояния в ступке54проводили 50% спиртом этиловым (60 и 40 мл) на кипящей водяной бане собратным холодильником в течение 40 и 20 минут. 2 мл извлечения переносили вцентрифужные пробирки, центрифугировали в течение 5 мин при 4500 об/мин.1,5 мл надосадочной жидкости помещали в виалы для хроматографирования ииспользовали для анализа.Пробоподготовка НГМ. 2 мл НГМ вносили в центрифужные пробирки,центрифугировали в течение 5 мин при 4500 об/мин. 1,5 мл надосадочной жидкости помещали в виалы для хроматографирования и использовали для анализа.Для приготовления стандартных растворов ГКК с концентрацией 0,005мг/мл 5 мг вещества вносили в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяли в20 мл метанола и доводили объем до метки, а затем аликвоту 5 мл переносили вколбу вместимостью 50 мл и доводили объем метанолом до метки.Для анализа извлечений из ГомЛРС/НГМ подснежников применяласьсистема для ВЭЖХ Agilent 1100 Series HPLC System (Agilent Technologies, США).В её состав входили: жидкостной хроматограф Agilent 1100 Series (AgilentTechnologies, США) оборудованный дегазатором, насосом, который обеспечивалподачу 2-х компонентов ПФ одновременно, устройство для автоматическоговведения проб (автосемплер) с термостатом образцов (температура виал собразцами – 15°С), термостат для хроматографических колонок, УФ-детекторAgilent 1100 Series (Diode Array).
Полученные хроматографические данныеобрабатывались с использованием ПО ChemStation.НФ – колонка ProteCol C18 НРН125 250×4,6 мм, 5 мкм. ПФ: «А» – 0,1%раствор муравьиной кислоты, «В» – ацетонитрил. Градиентный режим элюирования представлен в таб. 2.2.3.1. Скорость подачи ПФ – 1 мл/мин. Температураколонки – 25 °C. Объем вводимой пробы – 10 мкл.Таблица 2.2.3.1.Градиентный режим элюирования ГККВремя, мин0183035А,%95777050В,%5233050552.2.4. Определение органических кислотОпределение органических кислот (ОК) осуществляли методом ион-парнойВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием при длине волны 330 нмв режиме изократического элюирования.
Содержание ОК определяли в пересчетена соответствующий стандарт.Пробоподготовка ГомЛРС. Двукратную экстракцию ОК из ГомЛРСподснежников (4,0 г.), измельченного до кашицеобразного состояния в ступкепроводили подщелоченной водой 1М NaOH (60 и 40 мл, pH=8,5 мл) на кипящейводяной бане с обратным холодильником в течение 40 и 20 минут, посленейтрализовали до pH=5,5 1М HCl. 2 мл полученного извлечения упаривали нацентрифужном вакуумном испарителе при 30 °C и восстанавливали 2 млподвижной фазы, помещали в центрифужные пробирки, центрифугировали втечение 5 мин при 4500 об/мин.
1,5 мл надосадочной жидкости помещали в виалыдля хроматографирования и использовали для анализа.Пробоподготовка НГМ. 2 мл НГМ упаривали на центрифужном вакуумномиспарителе при 30 °C и восстанавливали 2 мл подвижной фазы, помещали вцентрифужные пробирки, центрифугировали в течение 5 мин при 4500 об/мин.1,5 мл надосадочной жидкости помещали в виалы для хроматографирования ииспользовали для анализа.Для каждой органической кислоты (янтарной, яблочной и щавелевой)готовили 3 стандартных раствора с концентрацией 0,1, 0,05 и 0,025 мг/мл.Растворы яблочной и щавелевой кислот готовили путем растворения навески 50,0±0,1 мг при 25 °C, а янтарной – при 60 °C в подвижной фазе с последующимразбавлением до необходимой концентрации.Разделение компонентов проводили сиспользованиемжидкостногохроматографа Agilent 1260 Series (Agilent Technologies, США), состоящего изнасоса (обеспечивает подачу 4-х растворителей одновременно), устройства дляавтоматическоговводапроб(автосемплера)стермостатом,термостатахроматографических колонок, УФ-детектора Agilent 1260 Infinity Diode ArrayDetector (DAD) под управлением ПО для обработки хроматографических данных56ChemStation (ver.
B.01). Применялась универсальная колонка для ОФ-ВЭЖХ наоснове октадецилселикагеля Waters Atlantis dc18, 5 мкм, 4.6 х 250 мм. Подвижнуюфазу готовили следующим образом: к 970 мл раствора дигидрофосфата калия0,01М добавляли 1,0 мл 20% тетрабутиламмония гидроксида и 30 мл метанола;pH =2,75 доводили с помощью 85% фосфорной кислоты. Скорость подачиэлюента (изократический режим) – 1,5 мл/мин. Температура колонки – 25 °C.Детектирование – УФ, λ=210 нм. Объем вводимой пробы – 10 мкл. Концентрацииорганических кислот в пробах рассчитывали по площадям хроматографическихпиков методом линейной градуировки.2.2.5.
Определение аминокислотПробоподготовка ГомЛРС/НГМ. Точную навеску массой 3,0 г ГомЛРСподснежников, растёртого в ступке до кашицеобразного состояния, помещали вплоскодонную колбу со шлифом, вместимостью 100 мл, добавляли 25 мл водыочищенной, взвешивали и проводили нагревание в течение 45 мин на кипящейводяной бане с обратным холодильником.
Затем полученное извлечениеохлаждалидокомнатнойтемпературы,проводиливзвешиваниеипринеобходимости доводили водой очищенной до первоначальной массы, затемфильтровали через бумажный складчатый фильтр. 1-ю порцию фильтрата – 15 млотбрасывали. Из следующей порции элюируемого фильтрата отбирали аликвоту,объемом 50 мкл, упаривали на вакуумном центрифужном испарителе досуха притемпературе 30 °C.Отбирали 500 мкл НГМ подснежника и упаривали досуха на центрифужномвакуумном испарителе при температуре 30 °C.К полученному сухому остатку ГомЛРС/НГМ добавляли 200 мкл 0,1 М р-рахлористоводородной кислоты, проводили нагревание на водяной бане притемпературе 60 °C в течение 20 мин, перемешивали и центрифугировали втечение 5 мин при 4500 об/мин.
50 мкл гидролизата использовали для анализа.Определение компонентного состава и содержания аминокислот вводорастворимых фракциях проводили на высокоскоростном аминокислотноманализаторе, фирма «Hitachi» (Модель 835, Япония). В качестве неподвижной57фазы использовалась колонка с внутренним диаметром 40 мм, длинной 150 мм,наполненная катионообменной смолой марки Hitachi Custom ion-Exchange Resin№ 2619. В качестве подвижной фазы использовалась смесь, в которую входилиNa-цитратные буферные растворы (I-й – 0,18 н (рН=3,25); II-й – 0,3 н (рН 3,9); IIIй – 1,6 н (рН=4,75)).Приготовлениенингидриновогореактива–растворанингидрина(нингидрин 1-водный, ТУ 6-09-5043-86) – на основе монометилового эфираэтиленгликоля (ТУ 6-09-4398-77).Программа подачи буферных цитратных растворов – стандартная (скоростьпотока 32 мл/час).
Скорость подачи нингидринового реактива составляла 20мл/час. Проходя через аналитическую колонку разделённые аминокислотыпоследовательно переходили в смесительный блок, где смешивались снингидриновым реактивом в соотношении 2:1. Время образования окрашенныхпродуктов взаимодействия аминокислот с нингидрином составило 4 мин принагревании в реакционной бане до 100 °C. Колориметрическое детектированиеокрашенных комплексов, которые образовывались в ходе реакции с нингидрином,проводилось при 2-х длинах волн одновременно в непрерывном режиме.Комплексы первичных аминов с нингидрином окрашены в пурпурный цвет(аналитическая длина волны – 570 нм), а комплексы вторичных аминов (пролин иоксипролин) обладают желтой окраской (аналитическая длина волны – 440 нм)[131].2.2.6.
Определение углеводовАнализ свободных и связанных сахаров проводился методом прямофазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим и УФ-детектированием. Более подробноусловия анализа и пробоподготовка НГМ представлены в работах [35, 134].Пробоподготовка ГомЛРС для анализа свободных углеводов. Образцызамораживали, помещая их в жидкий азот, измельчали немедленно в ступке спестиком.
В пробирку объёмом 2 мл помещали 300 мг (точную навеску)измельчённого образца, прибавляли 1 мл воды очищенной, экстрагировали на УЗванне в течение 60 мин, при комнатной температуре 25 °C. Полученное58извлечение центрифугировали в течение 15 мин при 4500 об/мин, затемдобавляли 30 мг угля активированного, встряхивали на вортекс-шейкере иповторно центрифугировали в течение 10 мин при 4500 об/мин.
1,5 млнадосадочной жидкости переносили в виалы для хроматографирования.Пробоподготовка ГомЛРС для анализа связанных углеводов. Образцызамораживали, помещая их в жидкий азот, измельчали немедленно в ступке спестиком. В пробирку объёмом 2 мл помещали 300 мг (точную навеску)измельчённого образца, прибавляли 800 мкл 2 М соляной кислоты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
