Диссертация (1141381), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Однако большая стабильность липосом на основенасыщенных липидов позволила использовать для стерической стабилизацииболее низкое содержание ПЭГ (около 1 моль%). Данное содержание было решеноиспользовать и в нашей работе для стабилизации частиц на основе соевогофосфатидилхолина.3.1.2 Получение больших многослойных липосом (МЛВ)Методы получения липосом описаны в Главе 2 (пункты 2.3.1, 2.3.2, 2.3.3)Промежуточным продуктом получения липосомальных наночастиц являетсясуспензия многослойных липосом.Для выбора оптимального состава было наработано 4 модели липосом сразличным липидным составом, три из которых на основе насыщенного соевогофосфатидилхолина (HSPC) с различным содержанием холестерина (от 30 до 50моль%) и одна на основе яичного фосфатидилхолина (EPC) основу составакоторой составила композиция ранее исследованная в РОНЦ им.
Н.Н. Блохина[38,39]. Липидные композиции представлены в Таблице 7 и Таблице 8.70Расчет липидной композиции производился таким образом, чтобысуммарное количество(моль) липидов – компонентов каждой смеси былоодинаковым. Данным подходом достигалась точность формирования липидныхсмесей, а именно близкое количество молекул, составляющих липидную смесь.Таблица 7 – Липидный состав МЛВ№Липидып/пМольМол. Вес,Конц.,МолярноеСуммарно%г/мольмг/млсоотношениеМольлипидов1S–PC350779,767,7910Холестерин49,5386,73,829,9DSPE – PEG–20000,52805,50,280,1Σ = 0,0002Σ = 11,92S–PC370779,7610,9114Холестерин29,5386,72,285,9DSPE – PEG–20000,52805,50,280,1Σ = 0,0002Σ = 13,473S–PC360779,769,3512Холестерин39,5386,73,057,9DSPE – PEG–20000,52805,50,280,1Σ = 0,0002Σ = 12,684EPC52,38760,097,96210,47Холестерин42,86386,73,3148,57DSPE – PEG–20004,762805,52,6700,95Σ = 13,94Σ = 0,000271Таблица 8 – Навески, использованные при приготовлении МЛВ различныхлипидных составов.№Молярный процентЛипиды1234Масса навески в граммахлипидовS–PC3500,0779Холестерин49,50,0382DSPE – PEG–20000,50,0028S–PC3700,1091Холестерин29,50,0228DSPE – PEG–20000,50,0028S–PC3600,0935Холестерин39,50,0305DSPE – PEG–20000,50,0028EPC52,380,0796Холестерин42,860,0331DSPE – PEG–20004,760,0267В ходе исследования производился анализ размеров дисперсий МЛВ послесмывкитонкойлипиднойпленки.ЗначениясреднегодиаметраМЛВпредставлены в Таблице 9.
Из приведенных данных видно, что размеры МЛВраспределены в диапазоне от 400 до 700 нм. Составы липосом на основенасыщенного соевого фосфатидилхолина имели различное распределение поразмерам в зависимости от состава. Наименьшими показателями размера 479± 58нм обладали МЛВ с содержанием холестерина в 39,5 моль%. Увеличениесодержания холестерина в сторону значений, близких к бинарной смеси (49,5моль%), незначительно увеличивало размеры МЛВ до 528± 167 нм.
Следуеттакжеотметить,чтоприувеличенииразмеровтакжерасширялосьираспределение значений. Уменьшение содержания холестерина до 29,5 моль%вызывало увеличение размеров МЛВ. Данный факт может быть обусловленизменениями жесткости липидной мембраны при различных концентрацияххолестерина.
Холестерин увеличивает текучесть мембраны, состоящей изнасыщенных липидов, что влияет на размеры частиц МЛВ, получаемых при72смывке липидной пленки. Повышение содержания холестерина до уровнябинарной смеси снижает стабильность размеров получаемых МЛВ и расширяетдиапазон их размеров. В свою очередь, меньшее содержание холестерина такжеприводит к увеличению диаметра получаемых МЛВ. Состав на основененасыщенного яичного фосфатидилхолина показал малые значения среднегодиаметра МЛВ (421± 79 нм), сопоставимые с минимальными значениями длядисперсий на основе насыщенных липидов.Таким образом, наименьшими размерами обладали МЛВ составов №3 и №4,что делает их наиболее предпочтительными при проведении экструзии черезмембранные фильтры.Таблица 9 – Средний Диаметр МЛВ№СоставСоотношение липидовДиаметрЛипид:Хол:ДСФЭ-ПЭГвезикул, нммолярноеВ моль%1S PC–3:ХОЛ:mPEG2000DSPE10:9,9:0,150:49,5:0,5528± 1672S PC–3:ХОЛ:mPEG2000DSPE14:5,9:0,170:29,5:0,5673± 493S PC–3:ХОЛ:mPEG2000DSPE12:7,9:0,160:39,5:0,5479± 584E PC:ХОЛ:mPEG2000DSPE11: 9: 152:43:4,7421± 793.1.3 Получение малых однослойных липосом (МОЛ)Малые однослойные липосомы, могут быть получены множеством методов,подробно описанных в Главе 1.
Однако наиболее распространенным влабораторной практике, является метод экструзии через поликарбонатныемембранные фильтры с определенным размером пор. Преимуществами данногометода для нашей работы являлась главным образом, способность получениямалых партий липосом с наиболее однородными размерами. В связи свышеупомянутыми преимуществами, экструзионный метод был выбран в нашейработе для получения МОЛ.Важным параметром для получения липосом данным способом являетсялипидный состав МЛВ и его свойства, такие как вязкость и температура фазовогоперехода гель – жидкий кристалл.
Так, мембрана липосом, состоящих из яичного73фосфатидилхолина, при комнатной температуре 25°С, находится в болееподвижном состоянии, что позволяет производить многократную экструзию черезполикарбонатные мембранные фильтры без подвода дополнительного тепла. Всвою очередь, насыщенные фосфолипиды, такие как гидрогенизированныйсоевый фосфатидилхолин, являются более ригидными в данном диапазонетемператур. Что требует для успешного проведения экструзии МЛВ на основенасыщенных фосфолипидов дополнительного подвода тепла [189]. Экструзию вэтом случае производят при температуре выше температуры фазового переходагель – жидкий кристалл.
Гидрогенизированный соевый фосфатидилхолинявляется смесью насыщенныхлипидов исостоит из 85% дистеароилфосфатидилхолина и 15% дипальмитоил фосфатидилхолина, температурыфазовых переходов для которых составляют ~ 41 – 42 °C и ~54 – 55 °Cсоответственно [150]. Таким образом, для наилучшей экструзии блок экструдеранагревали до 55 °C.Кроме того, важным фактором, для производства МОЛ экструзионнымметодом, является количество циклов пропускания через поликарбонатныймембранный фильтр.
Минимальным количеством циклов для получениястабильных размеров частиц является 5 [83,128]. Рекомендуемое производителемчисло циклов экструзии составляет более 7, однако отмечено, что большееколичество циклов увеличивает однородность получаемых частиц. В нашейработедлягарантированногополученияМОЛсболееоднороднымигеометрическими характеристиками использовалось 15 циклов экструзии. НаРисунок 11 и Рисунок 12 представлены результаты измерения размеров МОЛ,основными компонентами которых являются гидрогенизированный соевый ияичный фосфатидилхолин.74Рисунок 11 – Размеры дисперсии липосом на основе S PC–3Рисунок 12 – Размеры дисперсии липосом на основе E–PC.МОЛ получали методом, описанным в Главе 2. (пункт 2.3.2.).
ЭкструзиюМЛВ на основе яичного фосфатидилхолина проводили при комнатнойтемпературе, а МЛВ состоящие из S PC–3 экструдировали с подводом к блокутепла (при температуре 55 °С).На Рисунок 13 представлены результаты измерения диаметра МОЛразличного состава, полученные в результате экструзии. Размеры частиц послеэкструзии распределены от 145 до 101 нм. Липосомы состоящие из яичногофосфатидилхолина состава № 4 показали наибольшее значение размеров, чтовероятно связано с большей текучестью липидной мембраны на основененасыщенных липидов, однако данные результаты вполне согласуются сданными полученными в предыдущих исследованиях данной композиции.Размеры липосом на основе насыщенного соевого фосфатидилхолина различногосостава были распределены в интервале от 101 до 119 нм, что в среднем меньше75чем размеров липосом на основе яичного фосфатидилхолина. Данный факт можетобуславливаться большей ригидностью слоя насыщенных липидов.
Стоитотметить, что липосомы на основе насыщенных липидов также распределилисьпо размерам в зависимости от содержания холестерина. Наименьшимизначениями обладали липосомы с содержанием холестерина близким к бинарнойсмеси состава №1 (101 нм) и с содержанием холестерина близким к 40 моль%(105 нм). Наибольшие значения для липосом из насыщенных липидов показалсостав №2 с 30 моль% содержанием холестерина. Данные различия размеров, также могут быть обусловлены различием физических свойств мембран.Рисунок 13 – Диаметр везикул различного липидного состава.Размер Везикул (нм)15514513512511510595(E PC)(S PC-3)(S PC-3)(S PC-3)52,38:42,8650:49,5:0,5 70:29,5:0,5 60:39,5:0,5:4,76Диаметр Везикул (нм)101119105145Для оценки стабильности дисперсии липосом состава № 3 на основе соевогофосфатидилхолина производилось измерение показателя электрофоретическойподвижности ζ (дзета) – потенциала.
В дисперсии липосом состава № 3 ζ –потенциал составил – 68,61 ± 3,4 мВ. Отрицательный показатель ζ – потенциаласвидетельствует об отрицательном заряде частиц и вероятно связан с наличием наповерхности образца отрицательно заряженных фосфоэфирных групп ПЭГДСФЭ, данный факт также отражен в исследованиях подобных липидныхкомпозиций [111,112]. В свою очередь, значение заряда, превышающее ± 30 мВ,свидетельствует о хорошей стабильности липосомальной дисперсии и малой76склонности к образованию конгломератов [7]. Кривые измерения ζ – потенциалачастиц представлены на Рисунок 14.Рисунок 14 – График измерения ζ (дзета) – потенциала липосомальнойдисперсии состава № 3.3.1.4 Загрузка препаратаВыбор оптимальных условий загрузкиПолученные МОЛ нагружали препаратом спомощью метода активнойзагрузки, подробно описанного в Главе 2 (пункт 2.3.3.). Липосомы ,состоящие изяичного фосфатидилхолина , загружались согласно методике, разработаннойранее и проверенной для данного типа липосом Хугаевой [38,39].
Для липосом,состоящих из соевого фосфатидилхолина выполнялся подбор оптимальныхусловий проведения загрузки, в виду специфической структуры их мембраны.Первоначально,производилась попытка загрузки при условиях, сходных сусловиями для яичного фосфатидилхолина (125мМ раствор сульфата аммония;12ч при 4°C), однако в результате включение препарата составило 40%, чтоявляется низким показателем для активной загрузки.На РисункеРисунок 15представлена хроматограмма липосом загруженных без подвода тепла. Как видноиз представленного рисунка – большая часть загружаемого препарата находиласьвне липосом.77Рисунок 15 – Хроматограмма очистки липосоммитоксантрона отнезагруженного препарата : I – фракция липосом с митоксантроном; II – Незагруженный мтоксантрон.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
