Диссертация (1141381), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Принцип работы прибора: в качестве источника света использован лазер сдлинной волны λ = 632,8 нм. Под фиксированным углом определяетсяотраженный свет от ансамбля частиц, суспензированных в растворителе (в53данном случае деионизированная вода). Интенсивность этого света колеблется вовремениблагодаряхарактеристическоедиффузиивремячастиц.жизниСуществуетэтихчеткоколебаний,определяемоекотороеобратнопропорционально диффузии частиц. Далее просчитывается автокорреляционнаяфункцияфлуктуирующейинтенсивностиистроитсяубывающаяэкспотенциальная кривая зависимости от времени. Оценивают результат спомощью Гауссовского анализа (Gaussian) (обработка полученных даннымметодом наименьших квадратов – анализ по двум параметрам). Гауссовыпопуляции имеют четко определяемый средний диаметр частиц.
Однако этотподходможетбытьиспользовантолькодляпростыхраспределений:симметричных унимодальных популяций. Ассиметричные унимодальные ибимодальные распределения не возможно интерпретировать с помощью данногоанализа. Единственным признаком наличия более сложного распределенияявляется высокое и растущее значение квадратичного отклонения. Этираспределения оценивают с помощью Никомповского анализа (Nicomp). Данныйанализ дает в результате 3 или 4 параметра, по которым можно судить ораспределении липосом в образце (в %).NanoBrook Zeta Plus Zeta Potential Analyzer (Brookhaven InstrumentsCorporation, США)Предназначендля измеренияZeta – потенциала вслабосоленых водных растворах / суспензиях.Спектрофотометр DU 800 (Beckman Coulter Inc, США) Предназначен дляколичественного и качественного анализа, спектрофотометрических измерений вUV и видимой областях электромагнитного спектра.
Работает в диапазоне длинволн от 190 до 1100 нм и имеет спектральную ширину щели ≤ 1.8 нм.Твердотельный термостат ТТ1 (ДНК – Технология, Россия)Анализатор Униплан (ЗАО Пикон, Россия) предназначен для измеренияоптическойплотностипробвстандартномпланшетеиз96луноквавтоматическом режиме (принцип действия – вертикальная фотометрия).Диапазон длин волн прибора – 405–650 нм.54СистемаочисткиводыElix 5(MilliporeS.A.S.,Франция).Производительность – 5 л/час (± 15 % при 7 °C< T <30 °C).
Объединяет несколькотехнологий очистки воды. По международной классификации (стандарты CAP,CLSI и ISO 3696/BS 3997) вода, произведенная системой, относится к типу II(вода аналитической степени чистоты).Хроматографические колонкиC 10/20 (Amersham Biosciences, Швеция). Диаметр колонки – 10 мм, высотаколонки – 20 см, объем колонки – 14 мл, высота геля в колонке – 18 см.Хроматографическая системаНасос PD 5201 (Heidolph Instruments, Германия)Детектор ABI 757 Absorbance Dtector (Applied Biosistems, США), диапазондлин волн от 190 нм до 800 нм, чувствительность 0,005 – 2 AUFS, периодобновления от 0,1 до 2 сек.Самописец BD 41 – Recorder (Kipp & Zonen, Голландия) Двухканальныйаналоговый самописец.Хроматографическая система АКТA prime plus (General Electric, США) –представляет собой автоматизированую систему для жидкостной хроматографии.Система включает запрограммированные методы для всех распространенныххроматографических технологий.Проточный цитофлюориметр FACS Canto II (Becton Dickinson, США).Сублимационная сушка GAMMA 1–16 LSC (Martin Christ, Германия)Пригодна для лиофильной сушки в круглодонных колбах и/или на полках.Вакуумный насос (Millipore S.A.S., Франция).ВесыВесы Sartorius Cubis (Sartorius AG, Германия).pH - метрыpH – метр Sartorius PP–20 (Sartorius AG, Германия).pH – метр Sartorius PT–10 (Sartorius AG, Германия).552.3 МетодыМетоды технологических исследований2.3.1 Метод получения больших многослойных липосомДля приготовления липосом использовали метод обращения фаз.
Точныенавески яичного и соевого фосфатидилхолина, холестерина, DSPE–PEG2000 и pNp–PEG3000–lipid (для иммунолипосом) растворяли в 7 мл хлороформа. Затемполученный раствор липидов переносили в круглодонную колбу вместимостью150 мл и упаривали органический растворитель на роторном испарителе подвакуумом (0,7 мбар) и температуре не выше 35±20С (для липосом состоящих изяичного фосфатидилхолина) или не выше 40±2 °С (для липосом из насыщенногосоевого фосфатидилхолина) до образования тонкой липидной пленки.
Пленкусушили под вакуумом (0,9 – 1 мбар) в течение 50–60 минут, для удаленияостаточного органического растворителя. Далее липидную пленку гидратировали3 мл 125 мМ раствора сульфата аммония (для липосом состоящих из яичногофосфатидилхолина) или 3 мл 300 мМ раствора сульфата аммония (для липосомсостоящих из насыщенного соевого фосфатидилхолина) при постоянномперемешивании до полного исчезновения пленки со стенок колбы и образованиябелой эмульсии (дисперсия больших многослойных липосом).2.3.2 Метод получения малых однослойных липосомДля получения малых однослойных липосом использовали экструзионныйметод. Дисперсию больших многослойных липосом состоящих из яичногофосфатидилхолинапоследовательнопродавливаличерезполикарбонатныемембранные фильтры «Nuclepore» с диаметром пор 400, 200 и 100 нм сприменением ручного мини экструдера, производилось не менее 15 цикловэкструзии через каждый мембранный фильтр.
Дисперсия больших многослойныхлипосомсостоящихизнасыщенногопродавливалась через поликарбонатныйсоевогофосфатидилхолинамембранныйфильтртакже«Nuclepore»56диаметром 100 нм при температуре 55 °С , дисперсию помещали в шприцы мини–экструдера, которые затем устанавливали на нагреваемый блок, затем шприцыоставляли на 10 минут – для выравнивания температуры, после чего начиналиэкструзию. Производилось 15 циклов экструзии.
Температура фиксировалась спомощью термометра на блоке мини–экструдера.2.3.3 Метод получения липосом с инкапсулированныммитоксантроном.Инкапсулированиепрепаратавиммунолипосомыосуществлялипопринципу активной загрузки с помощью ионного градиента сульфата аммония(NH4)2SO4, рН 5,5 [52]. Для загрузки точную навеску митоксантрона помещали вофлакон вместимостью 10 мл, растворяли 4 мл буфера 10мМ HEPES и 145 мМNaCl (pH 8,2–8,4). Количество необходимого митоксантрона для точной навескирассчитывалось согласно коэфиценту загрузки препарат : суммарные липиды,равному 0,12 : 1.
Далее к полученному раствору митоксантрона в буфередобавлялся 1 мл пустых липосом. Суммарный объем смеси, таким образом,составлял 5 мл. Далее pH дисперсии доводили до значения 8,5–8,6 иинкубировали 1,5 ч на водяной бане при температуре 45°С (Только для липосом,состоящих из насыщенного соевого фосфатидилхолина), затем 12 ч при 4°С ипостоянном перемешивании.2.3.4 Метод получения иммунолипосомальной конструкциимитоксантронаПроцесс получения иммунолипосомальной конструкции митоксантронанезначительно отличался от процесса получения липосомальных частиц. В составлипосомальной композиции вводился pNp–PEG3000–lipid. Далее на этапе загрузкиточную навеску митоксантрона помещали во флакон вместимостью 10 мл,растворяли рассчитанным объемом буфера 10мМ HEPES и 145 мМ NaCl (pH 8,2–8,4), добавлялся 1 мл пустых липосом, далее pH дисперсии доводили до значения8,5–8,6 и инкубировали 1,5 ч на водяной бане при температуре 45°С (Только для57липосом, состоящих из насыщенного соевого фосфатидилхолина), затем 12 ч при4°С и постоянном перемешивании.
Раствор антител добавлялся к дисперсии перединкубацией в холодильнике. Суммарный объем дисперсии не превышал 5 мл,расчет необходимого количества антител велся исходя из мольного соотношениябелок/pNP–PEG3000–lipid 1:40.2.3.5 Измерение диаметра везикулАнализ среднего диаметра полученных везикул и оценку их распределенияпо размерам проводили с использованием метода динамического лазерногосветорассеяния (DLS) с помощью прибора Nicomp 380 Submicron Particle Sizer.Образцыготовилисьнепосредственнопередпроведениемизмерений.Концентрация везикул подбиралась таким образом, чтобы частота импульсов нафотоэлектронном умножителе составляла от 200 до 600 кГц.
В качестведисперсионной среды использовалась деионизированная вода, прошедшаяпроцедуру дегазирования под вакуумом (75 кПа). В стеклянную кювету размером6x50мм вносили 20 мкл исследуемого образца (свежеприготовленных везикул) идобавляли деионизированную воду до 1мл. Затем кювету помещали в прибор иначинали процесс измерения. Свет от источника (лазера) в наносайзерефокусируется внутри стеклянной пробирки или кюветы с разбавленнойсуспензией частиц.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
