Диссертация (1141381), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В каждой пробе анализировалось5000 событий.2.3.14 Оценка цитотоксической активности липосомальнойформы и иммунолипосомальной конструкции митоксантрона МТТ–тестом in vitroМТТ–тест, был впервые предложен Mosmann T. et al. [183] Данный опытоснован на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно–желтыйводорастворимый 3–(4,5–диметилтиазолин–2)–2,5 дифенилтетразолий бромид(МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде. Количествообразовавшегося формазана, определяемое колориметрическим методом послеего растворения в органических растворителях, характеризует интенсивностьокислительно–восстановительных процессов в клетках культуры и являетсякосвенной характеристикой активной биомассы.
При исследованиях, проводимыхна суспензионных культурах, клетки в концентрации 5х10 4 клеток/мл засевали в96–луночные круглодонные планшеты.Для оценки способности иммунолипосом, загруженных митоксантроном,избирательнодоставлятьлекарственныйпрепараткклеткам–мишеням,исследуемые образцы инкубировали с клетками в течение 1 часа при 4°C такжепроизводилось исследование без проведения инкубации на холоду. После этогоклетки отмывали и оставляли в СО2–инкубаторе при 37°C и 5% СО2 на 47 ч.Контролем служили клетки, которые инкубировали в тех же условиях.
Общеевремя инкубации составило 48 ч. За 6 ч до окончания инкубации в каждую лункувносили раствор МТТ (концентрация 5мг/мл). По окончании инкубациипланшеты центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин, надосадочную жидкостьудаляли. Осадок растворяли в 150 мкл ДМСО и помещали планшеты на 5–765минут в термостат при температуре 37°С. Далее, планшеты встряхивали нашейкере, после чего интенсивность окрашивания измеряли на спектрофотометре«Униплан 2000» при λ=492 нм. Величина поглощения прямо пропорциональначислу живых клеток.Процент живых клеток вычисляли по формуле:,где N0 – процент живых клеток; N1 – средняя оптическая плотность лунок,содержащих клетки и препарат; N2 – средняя оптическая плотность контрольныхлунок, содержащих только клетки; n – оптическая плотность лунок, содержащихтолько митоксантрон.Для каждого препарата строили график зависимости «доза–эффект».Статистический анализ полученных результатовСтатистический анализ проводили с использованием программ MicrosoftExcel, Statisticav.5.0.,IBM SPSS Statistics 21.
Различия считали статистическидостоверными при p≤0,02 и p≤0,05, использовали t–критерий Стьюдента,односторонний и двусторонний точный критерий Фишера.ЗаключениеДляпроведениялабораторныхисследованийбылиподобранылекарственные вещества, компоненты липидной мембраны, растворители иреагенты, отвечающие требованиям нормативных документов. В исследованиибыли использованы как методы изготовления ЛЛФ и ИЛЛФ, так и методыанализаполученныхконструкций.Представленыметодикисравненияцитотоксической активности ЛЛФ и ИЛЛФ митоксантрона в опытах in vitro ,методы оценки специфичности ИЛЛФ с антителами к HER-2 neu.66ГЛАВА 3.Разработка состава и технологии получениялипосомальной формы митоксантрона3.1 Технология получения липосомальных дисперсиймитоксантронаЛипосомыявляютсяуниверсальнойплатформойдлядоставкилекарственных средств, в качестве которых могут выступать витамины,ферменты, гормоны и различные химиопрепараты.
Эффективность включениялекарственного вещества в липосомальную структуру главным образом зависитот физико-химических свойств самого вещества (растворимости в воде, заряда,состава и размеров) и свойств липосомальной структуры (объема внутреннегопространства липосомы, состава мембраны). При использовании липидныхсубстанций обладающих высокой степенью очистки процесс получения липосомзагруженных антрациклиновыми антибиотиками сводится к ряду основныхстадий:1. Получение липидной пленки2. Эмульгирование липидов в буферном растворе3.
Уменьшение размеров полученных частиц одним из известных методов,4. Загрузка частиц препаратом,5. Очистка от незагруженного вещества,6. Стерилизующая фильтрация7. Замораживание с последующей лиофилизацией.Иммунолипосомальные конструкции получают путем не значительноймодификации состава полученных пегилированных липосом с помощьюсинтетических липидов. Как правило, векторные молекулы прикрепляют ксинтетическим липидам либо заранее (перед получением липидной пленки) либона стадии загрузки частиц препаратом. Основными параметрами качестваполучаемых ЛЛФ должны являться: размер везикул, стерильность, безвредностьсодержание включенного в липосомы препарата , pH и др.
При разработке ИЛЛФ67также необходимо учитывать такие параметры как количество молекул антител наодну липосому и специфичность закрепленных молекул.Основными технологическими задачами в процессе разработки ИЛЛФмитоксантрона были:-выбор оптимальной липидной композиции-отработка методов включения препарата в липосомы-отработка метода присоединения антител-исследование биофармацевтических характеристик in vitro.3.1.1 Выбор липидных композицийДлядостиженияосновнойцелиисследования–полученияиммунолипосомальной конструкции митоксантрона было решено использоватьряд моделей липосомальных конструкций.В первую очередь производилсявыбор основного липида в липидной смеси. Существующие в настоящее время нафармацевтическом рынке липосомальные конструкции описаны в Главе 1(пункты 1.4, 1.6 ).
Большинство ЛЛФ существующих на рынке создано на основеяичного (EPC) и насыщенного соевого фосфатидилхолина (HSPC). Это, преждевсего, связано с удобством получения данных липидов, их низкой стоимостью поотношениюк«чистым»липидам,атакжеудобствомприменениявфармацевтическом производстве. Кроме того, физико-химические свойстваданных липидов хорошо изучены. Исходя из данных фактов, в качестве основылипидной композиции было решено использовать именно насыщенный соевый ияичный фосфатидилхолин.Яичныйфосфатидилхолинактивноиспользовалсяприсозданиилипосомальных структур загруженных антибиотиками антрациклинового рядауже существующих на рынке, в частности препарата Myocet (Teva PharmaceuticalIndustries Ltd.).
Также он широко представлен в работах отечественныхразработчиковлипосомальныхлекарственныхформпротивоопухолевыхпрепаратов [1,8,13,16,38,39]. Кроме того, на базе яичного фосфатидилхолина в68РОНЦ им. Н.Н. БлохинаО.В. Хугаевой была создана липосомальнаялекарственная форма митоксантрона [38,39].В свою очередь, насыщенный соевый фосфатидилхолин (HSPC) являетсяосновой липидной композиции первого успешного липосомального препаратаDoxil/Caelyx (JanssenProducts, LP, США) и его аналога Lipo-dox (SUNPharmaceutical ltd., Индия).
Композиции на основе насыщенного соевогофосфатидилхолина хорошо изучены и активно применяются в разработке новыхлипосомальных и иммунолипосомальных форм антибиотиков антрациклиновогоряда [170,171].Важным компонентом липидной мембраны является холестерин, онопределяет свойства липидного бислоя, а именно его механические свойства,упаковку липидных молекул, проницаемость липидной стенки. Также содержаниехолестерина оказывает влияние на захват липосом клетками печени и селезенки впроцессе циркуляции в кровеносном русле и проникновение липосом втаргетируемыеклетки[201,51,95].Длялипосомнаосновеяичногофосфатидилхолина оптимальное количество холестерина было определеноэкспериментально при разработке липосомальной формы митоксантрона наоснове яичного лецитина в работе О.В. Хугаевойна уровне около 50% (вмолярных процентах)[38,39]. Такое количество холестерина обеспечиваетнеобходимую жесткость липидной мембраны и предотвращает утечку препарата входе его циркуляции по кровеносному руслу.Для липосом на основе насыщенного соевого фосфатидилхолина так жесуществуютэкспериментальныеданныеполипиднымкомпозициямиоптимальному количеству холестерина, связанные с разработками препаратаDoxil [95,48,49].
В большинстве случаев, оптимальными соотношениямихолестерина и насыщенного соевого фосфатидилхолина, являются соотношениялипид : холестерин, близкие к 2 : 1 (в молярном соотношении) или 70 : 30 (вмоль%). Данное количество холестерина обеспечивает наилучшие показателизагрузки и высвобождения широкого спектра химических веществ[64]. Также впоследнихисследованияхлипосомальныхкомпозицийбылипоказаны69приемлемые характеристики у смеси с соотношениями 60:40 (в моль%)[64].Известно, что максимальным количеством холестерина, используемым влипосомальных композициях, является его содержание на уровне 50 моль%.Холестерин в смесях с насыщенными липидами увеличивает их проницаемость,снижает температуру фазового перехода гель – жидкий кристалл и определяетструктуру липидной стенки, важную при производстве липосом [64,144].
Такимобразом, для выявления наилучшей для включения митоксантрона композиции,былорешеноисследоватьтрилипидныхсоставанаосновесоевогофосфатидилхолина с различным содержанием холестерина (30, 40 и 50 моль%).Для предотвращения захвата посредством РЭС, стерической стабилизациилипосомальныхчастицвсоставбылвведенПЭГ-ДСФЭ-2000.Самымраспространенным содержанием ПЭГ-ДСФЭ-2000 применяемым в ССЛ является4-6 моль%. Данное содержание ПЭГ обеспечиваетнаилучшую стерическуюстабилизацию, структуру липидного бислоя и повышает термодинамическуюустойчивость частиц [112,111].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
