Диссертация (1141381), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Эмульсификация наиболее проста изавершается когда плотность органической фазы уравнивается с плотностьюбуфера (т.е. около 1). По этой причине эфир (плотность около 0,7) обычносмешивают с растворителем большей плотности, например трихлорфторметаном(плотность 1,4) для производства системы растворителей с плотностью, близкой кплотности воды.
Водная фаза, содержащая загружаемый материал добавляетсясразу в смесь фосфолипидов с растворителем, формируя двухфазную систему.Соотношение водной фазы и органической обычно составляет 1:3 для эфира и 1:6для смеси изопропилового эфира и хлороформа.Составы, использующие равные пропорции, липидов и органической фазытакже были опубликованы [232]. Две фазы несколько минут обрабатывают УЗ,формируя эмульсию типа «вода в масле», затем органическую фазу аккуратноудаляют под частичным вакуумом, на роторном испарителе при температуре 20–30°C. Давление обычно поддерживается на уровне 0,5 мБар для удаления36большей части органической фазы (используя впрыск азота для регулированиявакуума) и затем понижая осторожно до полного вытеснения растворителя.Удаление последних следов растворителя трансформирует гель в БОВ,которые могут быть использованы для инкапсуляции как малых так и большихмолекул.
Принципиальным недостатком данного метода является длительноевзаимодействие инкапсулируемого материала с органическими растворителями имеханическое встряхивание, условия которые могут стать причиной денатурациинекоторых белков. Однако более активное включение, чем в методе гидратациитонкой липидной пленки, является большим преимуществом, которое можеттолько увеличиться с развитием более безопасных систем растворителей[196,173].1.4.4 Характеристики липосомальных частицПри производстве липосомальных наночастиц большое значение имеютследующие показатели качества:Размеры везикулДля определения размера липосом используется множество различныхметодов:спектроскопиястатическогоидинамическогосветорассеяния,микроскопия, эксклюзионная хроматография, фракционирование в потоке приналичии поля, центрифугирование.Микроскопия.
Одним из наиболее распространенных методов изученияразмеров и морфологии липосомальных частиц является микроскопия. Вчастности используется трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) снегативным окрашиванием, методом замораживания-скалывания и крио ТЭМ.Электронная микроскопия позволяет получать значительную информацию овнешнем виде везикул, однако требует затрат значительных усилий и времени напробоподготовкуиРаспространеннымпреимуществом пополучениеметодомполнойявляетсякартиныразмероватомно-силоваяпопуляции.микроскопия.Ееотношению к ТЭМ является способность изучениястабильности липосом наряду с их морфологией и размерами.37Для разделения липосомальных частиц с целью последующего анализаиспользуютдваметода:эксклюзионнуюхроматографиюиметодфракционирования в потоке при наличии поля.Эксклюзионная хроматография (ЭХ).
Гель-хроматография является однимизпростыхспособовразделениялипосомальныхчастицпоразмерам.Фракционированию могут подвергаться частицы диаметром до 0,8 мкм (взависимости от сорбента). Недостатком данного метода является высокий рискадсорбции липосомальных частиц на сорбенте.Фракционирование в потоке при наличии поля (Field Flow Fractionation;FFF). Представляет собой метод разделения основанный на приложении поля ксуспензии или раствору, проходящему по длинному узкому каналу. При этомполе направлено перпендикулярно потоку жидкости и приводит к разделениючастиц по их мобильности.
Метод FFF может разделять коллоидные частицы свысоким разрешением от 1 нм до 1 мкм. Поле в данном методе может бытьпредставлено в виде ассиметричного потока жидкости через полупроницаемуюмембрану,гравитации,температурногоградиента,электрическогоилимагнитного поля. При исследовании размеров липосомальных частиц наиболееприменимвариантметодасиспользованиемпотокажидкостичерезполупроницаемую мембрану.Дляанализаразделенныхчастицмогутиспользоватьсяметодыдинамической спектроскопии светорассеяния и многоуглового рассеяния света.Динамическаяспектроскопиясветорассеяния(ДСР).Наиболеераспространенный метод анализа распределения размеров липосомальных частиц.Данный метод основан на измерении флуктуаций интенсивности рассеиваемогоот частиц света. Исследование методом ДСР проводятся в исходной жидкойсреде,чтоявляетсясущественнымпреимуществомприисследованиилипосомальных везикул.
Также к плюсам методики можно отнести малоевоздействие на пробу в ходе измерения, высокую чувствительность метода ималый расход образца при измерении.38Многоугловое рассеяние света (МРС) является развитием метода ДСР сиспользоваиием большего количества углов рассеяния света, чем в ДСР, гдеиспользуется угол в 90 º. Таким образом МРС позволяет наиболее точноопределять размер частиц, молекулярную массу, а также в некоторых случаяхполучить представление о форме частиц[97,242].Ламеллярность липосомЛамеллярность липосом созданных из различных компонентов или сиспользованием различных техник изготовления различается в широкихпределах.
Так, часть фосфолипидов, соприкасающихся с наружной средой можетварьироваться от 5% у больших МЛВ до 70% у МОВ [97]. В большинстве случаевчислобислойныхмембранможетбытьобнаруженосиспользованиемэлектронной микроскопии методом замораживания – скалывания и 31Р ЯМР. Прииспользовании метода ЯМР к липосомальной дисперсии добавляют ионы Mn2+.Ионы марганца взаимодействуют с наружной частью везикул уменьшая сигнал,что позволяет судить о количестве бислоев, составляющих липосомы. Так, 50%уменьшениесигналасоответствуетоднослойнымлипосомам,а25%–двухслойным [58].
Для анализа ламеллярности могут использовать такжемалоугловое рассеивание рентгеновских лучей и методы, основанные надобавлении в мембрану липосом флюоресцирующих агентов.Эффективность включенияЭффективность включения препарата в липосомальную дисперсию являетсяважнымпараметромопределяющимэффективностьдействияЛЛФ.Взависимости от физико-химических свойств ЛВ количественное определениеможет производиться с использованием спектрофотометрии, ферментногоанализа,флуоресцентнойспектроскопиииэлектрохимическихметодов[97,137,72].
При использовании различных методов разделения, таких как ВЭЖХили FFF процент включения может как отношение пика невключенного веществак пику стандарта ЛВ в исходной концентрации. Данный метод используется в томслучае, когда липосомы не подвергаются очистке. Для более точного анализадисперсию липосом могут предварительно отделять от невключившегося39препарата с помощью методов FFF, ЭХ, центрифугирования и диализа.
Данныйметод широко применяется при анализе утечки ЛВ липосомальных дисперсий прихранении и воздействии различных разрушающих факторов. Так как методыразделения могут потенциально вызывать утечку препарата, исследователи частоиспользуют методы не связанные с разделением. В литературе описаны методыиспользования 1H ЯМР, диффузной 2D ЯМР, электронного парамагнитногорезонанса (ЭПР) а также различные флуоресцентные методы [97].Для анализа эффективности включения в липосомах с антрациклиновымиантибиотиками наиболее простым и распространенным методом являетсяразделение ЛЛФ методом ЭХ или FFF, с последующим анализом пиков всравнении со стандартным образцом ЛЛФ в исходной концентрации.1.4.5 Методы активной загрузкиОдним из основных преимуществ липосом при медицинском примененииявляется их способность к загрузке значительных объемов лекарств, необходимыхдля обеспечения терапевтической эффективности.
Липидный бислой с толщиной8-10 нм является естественным барьером для многих субстанций включая ионы,заряженные молекулы и большие не заряженные водорастворимые молекулы,например сахара и белки. Такие вещества как вода, газы, аммиак и глицеролмогут проникать через мембрану свободно [79,84,44] . Таким образом, многиегидрофильные вещества, среди которых аминокислоты, соли, антибиотики, белкии сахара, могут быть инкапсулированы в гидрофильном ядре липосом исохраняться там продолжительное время с незначительными утечками втечениедлительногопериодавремени.Водорастворимыевеществамогутбытьинкапсулированы в липосомы посредством множества методов. Среди которых,можно выделить 2 вида:1.
Методы пассивной загрузки2. Методы активной загрузки.Методы пассивной загрузки являются наиболее простыми, так какзагружаемое вещество добавляют в липосомы непосредственно вовремя их40изготовления, однако эффективность этих методов при загрузке водорастворимыхпрепаратов относительно низкая ~ 50-60%. В свою очередь, методы активнойзагрузки позволяют перераспределить вещество таким образом, чтобы большаяего часть оказалась внутри липосом. Однако данный подход имеет рядограничений по отношению к инкапсулируемому веществу. Лекарство должнобыть способно, переходить из незаряженного состояния, при котором возможнадиффузия через мембраны, в заряженное. Способность агента к ионизации, всвою очередь зависит от его pKa и от локального значения pH [76]. Кроме тогоинкапсулируемый агент должен быть также хорошо растворимым.
Толькоамфипатические слабые кислоты или основания подходят под все эти требования.Ещеоднимтребованиемдляактивнойзагрузкиявляетсяналичиетрансмембранного градиента. Nichols и Deamer [190] были первыми, ктопродемонстрировал данный метод загрузкой амфипатических аминов в липосомыс помощью градиента pH. Впоследствии радиент создавались с помощью солейдругих оснований (например, аммония) [50,154,254]или слабых кислот,например (ацетат) [77,44]. В настоящее время множество лекарственных веществинкапсулированывлипосомысиспользованиемразличныхградиентов[156,251,257,266]. Для создания pH градиента, как правило, используютсяследущие методы:1.
Получение липосом в кислом буфере с последующей заменой еговнешним буфером с более высоким значением pH;2. Загрузка с помощью градиента сульфата аммония;3. Создание градиента pH за счет ионофоров.При загрузке в липосомы антрахиноновых антибиотиков чаще всегоиспользуются два метода: матод создания градиента pH с помощью цитратногобуфера и метод с использованием сульфата аммония.Использование pH градиента цитратного буфера. В основу данного методаположена проницаемость мембраны липосом для нейтральных форм слабыхоснований. Липосомы создаются с использованием 300 мМ цитратного буферадля создания кислого значения pH во внутреннем гидрофильном ядре (рН ≈ 4,0).41Затем кислотность внешней среды меняют посредством 20 мМ HEPES и 150 мМNaCl (рН 7,5), при этом добавляется также загружаемый препарат. ЗагружаемоеЛВ переходя в нейтральную форму, диффундирует сквозь липидную мембрану.Попадая в гидрофильное ядро липосомы, происходит протонирование молекулы имолекула ЛВ становится заряженной, теряя способность к диффузии сквозьлипидную мембрану[35].Использование pH градиента сульфата аммония.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
