Диссертация (1141381), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Каждая частица рассеивает свет из падающего пучка.Интенсивностьрассеяннойволнырегистрируетсядетектором.Продолжительность измерений составляла 10мин и более. На экране мониторанаблюдали кривую распределения липосом по размерам. Все математическиеоперации производились компьютерной программой.2.3.6 Получение чистой фракции дисперсии с митоксантрономметодом гель–фильтрацииОчистку липосомальной дисперсии от незагруженного препарата и МКА (вслучае иммунолипосом) для последующего анализа производилась методом гель–фильтрации.58Гель–фильтрацияпредставляетсобойхроматографическийметод,основанный на различной скорости диффузии молекул с различной молекулярноймассой. Используемые в данном методе сорбенты задерживают в своих порахмолекулы с малой молекулярной массой, снижая, таким образом, скорость ихпрохождения, молекулы с крупной молекулярной массой, в свою очередь, быстропросачиваются между гранул сорбента и раньше выходят из колонки.На хроматографическую колонку С10/20, заполненную сефадексом G–50 ипредварительно уравновешенную 0,15M раствором натрия хлорида в течение 1 ч(прискорости0,3–0,4мл/мин),наносили1мллипосомальнойилииммунолипосомальной дисперсии с митоксантроном.
В качестве элюирующегораствора использовался 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюциисоставляла 0,3 мл/мин и регулировалась перистальтическим насосом. Контрольпроцесса очистки производился с помощью детектора ABI 757 AbsorbanceDetector, настроенного на длину волны 215 нм и самописца BD 41,фиксировавшего разделение в виде пиков.2.3.7 Метод стерилизующей фильтрации везикул смитоксантрономДля постановки тестов in vitro свежеприготовленную дисперсию липосомили иммунолипосом с митоксантроном пропускали через мембранные фильтры сразмером пор 0,22 мкм в стерильных условиях.
Фильтрат собирали в стерильныйфлакон.2.3.8 Количественное определение инкапсулированногомитоксантронаДляопределенияиммунолипосомальноймитоксантронадисперсиивлипосомальнойприменялиилистандартнуюспектрофотометрическую методику количественного определения вещества сиспользованием рабочего стандартного образца (РСО) митоксантрона при длиневолны 242 ± 2нм. Исследование влияния вспомогательных веществ на59спектральныехарактеристикифосфатидилхолина,криопротекторовмитоксантронахолестерина,(сахарозы,показало,неприсутствиеpNp–PEG3000–lipidPEG2000DSPE,глюкозы)чтоизменяетиположенияхарактеристического максимума.
Измерение оптической плотности спиртовыхрастворов проводили относительно 95% этилового спирта в кюветах с толщинойоптического слоя 10 мм.Содержание митоксантрона (Х, мг) рассчитывали по формуле:где D – оптическая плотность раствора образца; D0 – оптическая плотностьРСО Мит; C – величина разбавления образца; C0 – величина разбавления РСОМит; а – навеска РСО Мит, мг.Эффективность включения митоксантрона в липосомы (B, %) рассчитывалипо формуле:где D1 – оптическая плотность раствора фракции с очищеннымилипосомальногоМит;D–оптическаяплотностьраствораисходнойлипосомальной дисперсии; C1 – величина разбавления фракции с очищеннымлипосомальным Мит; C – величина разбавления исходной липосомальнойдисперсии; V1 – объем фракции с очищенным липосомальным Мит, мл; V –объем исходной липосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл.Все растворы использовали свежеприготовленными.1.
Приготовление РСО митоксантрона:2,0 мг препарата (точная навеска)помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл и прибавляли 95% этиловыйспирт до метки, перемешивали (раствор А). Затем 2,5мл раствора А переносили вколбу вместимостью 25мл, прибавляли 95% этиловый спирт до метки.2.Приготовлениераствораисходнойлипосомальнойилииммунолипосомальной дисперсии с митоксантроном: 1мл свежеприготовленныхлипосом/иммунолипосом с митоксантроном переносили в мерную колбу60вместимостью 50 мл и доводили 95% этиловым спиртом до метки, перемешивали(раствор А). Затем 5мл раствора А переносили в колбу вместимостью 25мл,прибавляли 95% этиловый спирт до метки.3.Приготовлениерастворалипосомальным/иммунолипосомальнымфракциимитоксантроном:сочищенным1млполученнойфракции очищенной дисперсии с митоксантроном переносили в мерную колбувместимостью 25мл и доводили 95% этиловым спиртом до метки, перемешивали.2.3.9 Определение белка, связанного с поверхностью липосом сиспользованием медного комплекса бицинхониновой кислотыМетод основан реакции восстановления ионов Cu2+ до ионов Cu+ поддействиембелкаввысокочувствительнойщелочнойсреде(биуретоваяспектрофотометрическойреакция)регистрацииинаобразующихсяионов одновалентной меди (I) после их связывания в хелатные комплексы сбицинхониновойкислотой.Этикомплексыхарактеризуютсявысокойэкстинкцией около 562 нм, которая линейно зависит от концентрации белка вшироком рабочем диапазоне (от 20 до 2000 мкг/мл).
Для построениякалибровочного графика использовали стандартный раствор белка (бычьегосывороточного альбумина, БСА) в концентрации 0,2 мкг/мкл. Данный метод недопускает использования одного и того же калибровочного графика длянеодновременныханализов.Дляпроведенияанализасначалаготовилинеобходимое количество реакционной смеси — смешением бицинхониновойкислоты (200 мкл/ пробу) и 4% раствора CuSO4 (II) (4 мкл/пробу). При проведенииизмерения смешивали 10 мкл анализируемой пробы с 200 мкл реакционнойсмеси, инкубировали 30 минут при 37°С и фотометрировали при 565 нм.Калибровочный график строили в соответствии со схемой разбавлениястандартного раствора БСА, которая представлена в Таблица 6.61Таблица 6 – Схема приготовления серии растворов БСА дляпостроения калибровочного графика.№ ОбразцаОбъемОбъем реакционной смеси, мклОбъем стандартаH2O, мкл(БСА, k=2мкг/мкл), мкл120400–218400231640044124008584002644001672400188–400202.3.10 Расчет количества молекул на одну липосому.Количество молекул на одну липосому рассчитывалось исходя из формулы,впервые предложенной Huang и Mason[130].,Где: Ntot – общее количество молекул, Где– площадь одного измонослоев липосомы, d – диаметр липосом, h – толщина бислоя (около 5 нм), a –площадь «головки» липида 0,71 нм2.Таким образом, для однослойных липосом состоящих из фосфатидилхолинавышеописанное уравнение имело вид:,Где d – диаметр липосом.Так для липосомы, диаметром 100 нм число молекул на липосому равнялосьприблизительно 80 047.
Концентрация липидов в растворе являлась известнойвеличиной. Число липосом в растворе вычислялось исходя из молярного весалипидов, входящих в состав липосомы по формуле:62,Где Nlipo – число липосом; n1, n2, n3 – количество липидов (моль); Ntot –число молекул в одной липосоме ; NA – число Авогадро 6,021023.2.3.11 Метод измерения ζ (дзета) – потенциала липосомальнойдисперсииζ (дзета) – потенциал (показатель электрофоретической подвижности)липосомальной дисперсии определяли методом электрофоретического рассеяниясвета на приборе NanoBrook Zeta Plus Zeta Potential Analyzer (BrookhavenInstruments Corporation, США). Образцы готовились непосредственно передпроведением измерений.
В качестве дисперсионной среды использоваласьдеионизированная вода, прошедшая процедуру дегазирования под вакуумом (75кПа). В стеклянную кювету помещали 100 мкл исследуемого образца(свежеприготовленных везикул) и добавляли деионизированную воду до 1 мл.Затем кювету помещали в прибор и производили процесс измерения. Зетапотенциал дисперсии определяли при угле рассеивания света 15°. Результатыизмерения представляют собой значения измерений 5 независимых образцов.Рассчеты значений дзета – потенциала и мобильности частиц производилисьавтоматически, с помощью программы Particle Solutions v. 2.5.
Время измеренияодного образца составляло 10 минут и более.63Методы биологических исследований2.3.12 Метод оценки специфического связыванияиммунолипосомальной конструкции митоксантрона с клетками–мишенями методом непрямой реакции поверхностнойиммунофлуоресценции (РИФ)Способностьантител,связанныхсповерхностьюиммунолипосом,специфически связываться c антигеном–мишенью, проверяли на клетках линииSK–BR–3.Для проведения реакции 2,5х104 дважды отмытых в PBS клетокинкубировали с 20мкл немеченых МКА, ИЛКМ, липосомальной формымитоксантрона, а также пустыми иммунолипосомами, в течение 30 мин прикомнатной температуре. После чего клетки отмывали PBS центрифугированием втечение 7мин при 1200об/мин.
Затем клетки инкубировали в течение 30мин при4°С с 10мкл F(ab)2 фрагментов против иммуноглобулинов человека (рабочееразведение 1:500), меченой FITC. После чего клетки дважды отмывали PBS иресуспендировали в PBS, содержащем 1% формалин и 0,1% азид натрия.Результаты реакции анализировали методом проточной цитофлуориметрии.2.3.13 Проточно–цитофлуориметрический анализПроточно–цитофлуориметрическийанализпроводилинапроточномцитофлуориметре FACS Canto II (Becton Dickinson, США), укомплектованномаргоновым лазером (длина волны 488 нм), с использованием встроенногопрограммного обеспечения. Клетки анализировали на основе параметров,измеряемых проточной цитометрией. В момент прохождения через луч лазераклетки рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количествосвета за счет флуоресценции.
Прямое рассеивание света (FCS) (количество света внаправлении лазерного пучка под углом 0°) определяет размер и форму клеток,тогда как боковое (SSC) (под углом 90° по отношению к лазерному пучку)определяетструктурныеособенностиразличныхпопуляцийклеток.На64цитограмме устанавливали соответствующее окно дискриминации (гейт), вкотором на основании FSC и SSC вырезали основной пул клеток с цельюудаления мелких (дебрис) и крупных (агрегаты) частиц. Длина волны для зеленойфлуоресценции устанавливали в канале FL1 (515–545 нм). Данные получали влогарифмическом измерении для FL1 канала.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
