Диссертация (1141381), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Результатыданного исследования представлены на Рисунок 19 и Рисунок 20. Размериммунолипосомальнойконструкциипоотношениюклипосомальнойконструкции изменился незначительно: на 4 нм для липосом из насыщенныхлипидов и на 2 нм для липосом на основе яичного фосфатидилхолина. Размерчастиц при этом составил для иммунолипосомальной композиции на основесоевого фосфатидилхолина 109±6 нм, а для композиции на основе яичногофосфатидилхолина 147±8 нм.85Рисунок 19 – Распределение ИК Митоксантрона на основе соевогофосфатидилхолина по размерам, полученное на наносайзере Nicomp 380Submicron Particle Sizer.Рисунок 20 – Распределение ИК Митоксантрона на основе яичногофосфатидилхолина по размерам, полученное на наносайзере Nicomp 380Submicron Particle Sizer.3.3.1 Очистка иммунолипосомального митоксантронаОчистканевключившегосяиммунолипосомальнойпрепарата,конструкциинесвязавшихсямитоксантронамоноклональныхотантителпроводилась методом гель – фильтрации.
Контроль разделения осуществлялся сиспользованием спектрофотометрического детектора при длинне волны 215 нм.Полученные фракции собирались в стерильные пробирки и подвергалидальнейшему спектрофотометрическому анализу.Для более полного анализа разделения производилась гельфильтрация«пустых» иммунолипосом и липосом с загруженным митоксантроном. При86разделении «пустых» иммунолипосом по методике, описанной в Главе 2 (2.3.6) навыходеизхроматографическойсистемырегистрировалосьтрипика,соответствующих чистой фракции иммунолипосом, не связавшимся МКА изагрузочному буферу. Рисунок 21.
При анализе иммунолипосом, загруженныхпрепаратом регистрировалось четыре пика: иммунолипосомы загруженныемитоксантроном, несвязавшиесяМКА,загрузочныйбуферифракцияневключившегося митоксантрона. Рисунок 21. Наибольшую интенсивностьсветопоглощения показывали фракции, содержащие в себе, иммунолипосомы - ихпики на хроматограмме были наиболее выраженными. Данный факт обусловлених крупным молекулярным весом и оптическими свойствами липидов. Такжестоит отметить, что ИЛКМ митоксантрона имеют самое малое времяудерживания в связи с тем, что не взаимодействуют с сорбентом. Меньшуюинтенсивность светопоглощения показали фракции антител, митоксантрона,загрузочные буферы. Данные фракции также распределялись по времениудерживания в порядке уменьшения молекулярной массы частиц.Рисунок 21 – Хроматограмма «пустых» ИЛ от несвязавшихся МКА : I –фракция очищенных ИЛКМ; II – МКА HER–2 neu; III–.буфер HEPES с NaCl.87Рисунок 22 – Хроматограмма ИЛ митоксантрона от несвязавшихся МКА ипрепарата : I – фракция очищенных ИЛКМ; II – МКА HER–2 neu; III–.буферHEPES с NaCl; IV – не включившийся митоксантрон.3.4 Спектрофотометрическое определение содержаниямитоксантрона в иммунолипосомальной конструкции3.4.1 Определение влияния антител на спектрофотометрическиехарактеристики иммунолипосомального митоксантрона.Методики спектрофотометрического определения митоксантрона изложеныв Главе 2 (пункт 2.3.8).
Для определения влияния липосомальной конструкции наспектры поглощения митоксантрона исследовались соответственно: спектрыпоглощения митоксантрона, иммунолипосом с загруженным препаратом испектры поглощения липосом и иммунолипосом. В качестве растворителя вданных исследованиях использовали 95% этиловый спирт. Спектры поглощенияизмеряли в диапазоне длин волн от 200 до 800 нм в кюветах с толщинойоптического слоя 10 мм, относительно 95% этилового спирта.
Максимумыпоглощения митоксантрона полностью совпадали с описанными в литературеГлава 1.(пункт 1.3.1) и составляли 242±2 нм, 280±2 нм, 620±2 нм и 673±2 нм. НаРисунок 23 представлен спектр поглощения субстанции митоксантрона. По88результатам спектрофотометрического исследования в качестве аналитическойвыбрали длину волны, на которой пик митоксантрона был наиболее выраженными узким. Такой пик был определен при длине волны 242±2 нм.Рисунок 23 – Спектрофотометрия спиртового раствора субстанциимитоксантрона.Для определения влияния структуры липосом и иммунолипосом наколичественное определение митоксантрона исследовались спектры субстанциимитоксантрона,имитоксантроназагруженноговлипосомальнуюииммунолипосомальную форму.
В ходе исследования было выявлено, что спектрыпоглощениярастворовлипосомальнойииммунолипосомальнойформмитоксантрона были сходными по положению максимумов, интенсивности иформе кривой спектру чистой субстанции.На Рисунке 24 представлены результаты измерения оптической плотностиразличных форм митоксантрона.89Рисунок 24 – Спектрофотометрия cпиртового раствора:1Субстанции митоксантрона, 2- ЛЛФ, 3- HER–2–neu–ИЛЛФ.Для исследования влияния HER–2 neu и пустых липосом на спектральныехарактеристики митоксантрона изучались спектры поглощения разбавленных в20 раз растворов антител и липосом. Пример спектра поглощения растворапустых иммунолипосом представлен на Рисунок 25.Рисунок 25 – Спектрофотометрия пустых иммунолипосом: 1- HER–2–neu–ИЛЛФ, 2- «пустые» ИЛФ, 3- 95% спирт.90Было показано, что на спектры поглощения митоксантрона не влияюткомпоненты входящие в состав липосом, МКА в концентрациях, используемыхприприготовлениииммунолипосомизагрузочныебуферы.Максимумпоглощения «пустых» липосом наблюдается при длине волны 202±2 и неоказывает влияние на поглощение при аналитической длине волны 242±2 нм ванализируемых концентрациях.3.5 Определение количества моноклональных антител,связанных с поверхностью липосомОпределение количества белка, связанного с поверхностью липосомпроизводили методом, описанным в Главе 2 (пункт).
Однако определение белканаиммунолипосомальнойконструкциимитоксантронабылозатрудненоприсутствием препарата, образующего комплексы с бицинхониновой кислотой. Всвязи с этим, определение количества белка связанного с липосомамипроизводилось в препаратах пустых пегилированных имунолипосом, очищенныхотнесвязавшихсяМКА.Поданнымоптическойплотностирастворовстандартных образцов строилась калибровочная кривая, по которой определялосьсодержание белка в анализируемых образцах.
Рисунок 26.Рисунок 26 – Калибровочный график для определения белка сбицинхониновой кислотой.ОП.при длинне волны 562 нм0,450,400,350,300,250,200,150,100,050,000,000,020,040,080,12BSA, мкг/мл0,160,180,2091Рассчет количества антител на 1 липосому производился исходя из размералипосомальных частиц. Согласно данным, полученным в результате измеренийразмеров липосом, определялось количество молекул на одну липосому (Глава 2)пункт(2.3.10.) , затем рассчитывалось количество активных групп pNP–PEG3000–lipid на 1 липосому и соответствующее количеству антител, молекулярная массаМКА была известной и составляла 148 000 Дa. Среднее количество белка во всейочищенной фракции иммунолипосомальных частиц составляло 0,080 мг.Количество антител на 1 липосому в среднем составило ~ 20.
Таким образом, налипосомах было достигнуто необходимое количство антител для обеспечения ихспецифической доставки к клеткам-мишеням. Данное количество лигандов налипосому, согласно исследованиям иммунолипосомальных форм доксорубицина,является средним и обеспечивает наилучшее с точки зрения кардиотоксичности ибезопасности действие in vivo[221].3.6 Лиофилизация липосомального митоксантрона.Длительное хранение дисперсий липосом и ИЛЛФ в жидком видеосложняется дестабилизацией липидного бислоя, утечкой препарата из липосом,агрегацией липосом. Кроме того для ИЛЛФ важным фактором являетсясохранение антител в активном состоянии, которое легче поддерживается вусловиях, когда препарат находится в замороженном состоянии и в отсутствиеводы. Для продления срока хранения липосомальных и ИЛЛФ митоксантронабыли произведены исследования лиофилизации полученной формы на основесоевого фосфатидилхолина.Хранение липосом загруженных митоксантроном на основе яичногофосфатидилхолина хорошо исследовано в работе Хугаевой О.В[38,39].
Всвязи сэтим, вопросы, связанные с разработкой методов лиофилизации липосомальнойдисперсиибыли рассмотренытолькодлялипосом на основе соевогофосфатидилхолина.Для липосом и иммунолипосом на основе соевого фосфатидилхолина,соответствии с результатами, описанными в главе 3 и главе 4, в качестве рабочей92модели была избрана липосомальная форма состава №3. Её композиция изложенавТаблица 15. Для данного состава производился подбор технологиилиофилизации.Таблица 15 – Состав липосомальной лекарственной формымитоксантрона на основе насыщенного соевого фосфатидилхолина (Состав№3).ЛипидыМоль %Мол. Вес, г/мольМасса навески вграммахS–PC360779,760,0935Холестерин39,5386,70,0305DSPE – PEG–20000,52805,50,0028Лиофилизация липосомальных лекарственных форм производилась сиспользованием сублимационной сушки GAMMA 1–16 LSC (Martin ChristGefriertrocknungs anlagen GmbH, Германия).Лиофильная сушка растворов липосомальных частиц состояла из трехстадий:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
