Диссертация (1141381), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Условия хроматографии: колонка: C 10/20 (AmershamBiosciences); элюент: 0,15М NaCl; скорость элюции: 0,3 мл/мин; детектор надлинне волны 215 нм; температура колонки: комнатная.Полученный результат мог являться следствием низкой проницаемостимембран липосом из насыщенных липидов, которые находятся в твердомсостоянии при комнатной температуре. Известно, что смесь насыщенного соевогофосфатидилхолина и холестерина изменяет характеристики проницаемости приразличной температуре связанные с фазовыми переходами. В интервалекомнатных температур мембраны липосом из соевого фосфатидилхолинанаходятся в состоянии плохо проницаемого ламеллярного геля. При повышениитемпературы наблюдается двухстадийный фазовый переход: 45–47 °C (гель –неравномерныйгель),50–53°C(неравномерныйгель–жидкийкристалл)[145,144].
Проницаемость липидной стенки при этом меняется такжепостадийно и принимает максимальные значения при жидкокристаллическомсостоянии,фазанеравномерногогеляимеетчастичнуюпроницаемость.78Проведение активной загрузки при температуре фазового перехода гель-жидкийкристалл не целесообразно, так как скорость истечения сульфата аммония в этомслучае будет максимальна, что приведет к уменьшению движущей силы процесса.В связи с этим, наиболее удобной для загрузки температурой является интервалпредфазового перехода гель – неравномерный гель (45–47 °C).
В нашемисследовании инкубация производилась на водяной бане при температуре 45°C.Чтобы повысить эффективность загрузки липосом данного состава, было решенотакже увеличить концентрацию сульфата аммония в 2 раза (с 125 мМ до 250 мМ)с целью усиления градиента, так как насыщенные липиды в сравнении сненасыщенными имеют меньшие показатели проницаемости. Для определенияоптимального времени инкубации производилось исследование загрузки принагревании (использовался липидный состав 3).
Результаты выбора оптимальноговремени загрузки представлены на Рисунок 16.Рисунок 16 – Выбор оптимальных условий загрузки для липосом изнасыщенного соевого фосфатидилхолина.120Включение (%)100806040200Без подвода 30 мин 45°C 60 мин 45°C 90 мин 45°CтеплаСогласно полученным результатам были выбраны оптимальные условия дляпроведения процедуры загрузки липосомального митоксантрона, 1,5 часа притемпературе 45°C. Для проведения более полной процедуры загрузки и79стабилизации дисперсии после нагрева липосомы оставляли на 12 часов притемпературе 4°C, после чего производили дальнейшие исследования.Подбор оптимальной липидной композицииЭффектвность загрузки препарата в липосомы также зависит от составамембраны липосом и их размеров.
Кроме того, размер и степень загруженностилипосом влияет на эффективность действия липосомальной формы. Для выбораоптимальной липидной композиции загрузку препарата производили приразличных составах липосом, результаты представлены в Таблица 10 и Рисунок17.Таблица 10 – Результаты измерения загрузки липосом в зависимости отлипидной композиции.№БазовыйСоотношение липидовПроцентСреднийп/пЛипидмоль%загрузкидиаметр1S PC–350:49,5:0,585,6±4101±52S PC–370:29,5:0,594,9±4117±83S PC–360:39,5:0,596,9±3105±64E PC52,38:42,86: 4,7694,1±5145±7Рисунок 17 – Процент загрузки липосомальных дисперсий приразличных липидных составах.10098Включение (%)969492908886848280(S PC-3)50:49,5:0,5(S PC-3)70:29,5:0,5(S PC-3)60:39,5:0,5(E PC)52,38:42,86:4,7680Все липидные композиции показали сравнительно высокие показателизагрузки: от 85 до 97 %.
Меньшими показателями по размерам частиц и загрузкеобладают липосомы состава № 1 с содержанием холестерина около 50 моль%(101±5 нм и 85,6±4 % соответственно). Липосомы состава №2 с 30 моль%содержанием холестерина показалинаибольшийразмер,средилипосомсостоящих из насыщенных липидов 117±8 нм. При этом, показатели загрузкибыли сходны со значениями для липосом на основе яичного фосфатидилхолина94,9±4%. Средний диаметр липосом состава № 3 был незначительно вышелипосом с составом №1 и составлял 105±6 нм, однако обладал наилучшимипоказателямизагрузки96,9±3%.Дисперсиянаосновеяичногофосфатидилхолина при значительно больших размерах 145±7 нм показаласредние результаты по загрузке 94,1±5 %. Таким образом, наилучшимипоказателями по размерам дисперсии и загрузке препарата показала композициясостава № 3 (60:39,5:0,5).
В дальнейших исследованиях она спользовалась вкачестве базовой для создания иммунолипосомальной формы препарата на базенасыщенных липидов в сязи с ее теоретически большим потенциалом доставкицитостатика внутрь опухоли. Также в дальнейших исследованиях принялаучастие и липосомальная форма на основе яичного фосфатидилхолина №4(52,38:42,86:4,76).Подбор соотношения препарат : суммарные липидыВажным фактором для процедуры загрузки является массовое соотношениепрепарата к суммарным липидам. Данное соотношение, прежде всего, важно дляобеспечения полноты и максимальной эффективности загрузки конкретнойлипидной смеси.В11представлены результаты подбора оптимальногосоотношения загружаемого препарата в качестве модельной липидной смесииспользовался состав №3 (60:39,5:0,5).
При проведении эксперимента МОЛ содинаковымлипиднымсоставомисодержаниемзагрузочногоподвергались загрузке различными количествами препарата.буфера81Таблица 11 – Результаты подбора оптимального соотношения препарат :суммарные липиды.Концентрация№Весовое соотношениемитоксантрона впрепарат: липидыдисперсии,Включение митоксантрона влипосомы,%мг/мл10,12 : 1196,9±320,2 : 11,684,54±330,24 : 1267,3±10Согласно вышеописанным результатам, увеличение количества препарата,используемого при загрузке липосом, приводило к уменьшению значенийвключения, что свидетельствует о предельной загруженности препаратом.Наибольший процент включения был достигнут в весовом соотношении(препарат : суммарные липиды) 0,12 : 1. В дальнейшем данное весовоесоотношение использовалось для приготовления липосомальных композиций ииммунолипосомальных композиций на их основе.3.2 Количественное определение митоксантрона включенного влипосомы.Дляоценкиэффективностизагрузкиколичественноеопределениезагруженного и «свободного» митоксантрона производилось в две стадии.
Напервой производилась очистка препарата методом гельфильтрации описанным вГлаве 2. (пункт 2.3.6), и его разделение на две фракции (липосомальныймитоксантрон и свободный препарат). После чего производилась оценкаэффективности включения препарата путем определения общего содержаниямитоксантронависходнойдисперсииидвухполученныхфракциях.Спектрофотометрию производили согласно методике, описанной в Главе 2.(пункт 2.3.8)В 12 представлены результаты количественного определениямитоксантрона, ошибка определения среднего результата не более 1,0±0,05% .82На Рисунке 18 представлен пример гельфильтрации липосомальнойконструкции митоксантрона после подбора оптимальных условий загрузки.
Нарисунке видно два пика соответствующих первой фракции (липосомальногомитоксантрона) и второй фракции (незагруженный препарат).Таблица 12 – Пример количественного определения липосомальногомитоксантрона в I фракции.СерияОптическаяСодержаниеМетрологичеЭффективнМетрологическиепрепаплотность,МитоксантрскиеостьхарактеристикиратаI фракцияона вХарактериствключения,Липосомах,ики%мг/млx =0,97062506140205140,53080,96150,53570,97040,53800,97460,53840,97540,53580,97060,53040,96070,53160,96290,52470,95040,53370,96680,52830,9571S2 =0,0003Sх=0,0055Sx =0,0025Δ x =0,0001x =96,955496,6997,2596,0397,2597,56S2 =0,36634Sх=0,6053Sx =0,2707Δ x =0,7536 =0,0064 =0,7773x =0,9596x =95,9640S2 =0,0004Sх=0,0062Sx =0,002896,0896,3095,05S2 =0,38632Sх=0,6215Sx =0,278096,68Δ x =0,0001 =0,008395,71Δ x =0,7947 =0,828183Рисунок 18 – Хроматограмма очистки липосомальногомитоксантрона от несвязавшихся МКА и препарата : I – фракцияочищенных липосом с митоксантроном; II – Не загруженныймитоксантрон.3.3 Получение иммунолипосомальной конструкциимитоксантронаДлясозданияиммунолипосомальнойконструкциимитоксантронаиспользовалось две модели липидного состава.
Первая на основе яичного, втораяна основе насыщенного соевого фосфатидилхолина. В обоих липидных составахчасть ДСФЭ-ПЭГ-2000 частично заменялась нап-нитрофенилкарбонил-ПЭГ-3000-ФЭА (pNP-PEG-PE). Использование более длинных цепей PEG 3000обусловлено противодействием экранирования антител цепями ДСФЭ-ПЭГ-2000.Использование для создания иммунолипосомальной конструкции митоксантронаpNP-PEG-PEтакжеконьюгированиепозволиломоноклональныхпроизводитьантител.одностадийноеКонечныйэффективноелипидныйсоставиммунолипосомальных композиций представлен в Таблица 13 и Таблица 14.Загрузка препарата в липосомы производилась согласно методике указанной вГлаве 2 (пункты 2.3.3, 2.3.4).84Таблица 13 – Молярный процент липидов, входящих в составиммунолипосом на базе состава №3 и навески для приготовления МЛВ(расчет на 3мл).Молек.Молярный %МассаНавески дляприготовления МЛВS PC–3779,76600,0935Холестерин386,739,50,0305DSPE–PEG20002805,050,450,0025pNP–PEG3000–lipid34000,050,0003Σ =0,1269Таблица14–Молярныйпроцентлипидов,входящихвсоставиммунолипосом состава №4 (яичный ФХ) и навески для приготовления МЛВ(расчет на 3мл).Молек.Молярный %МассаНавески дляприготовления МЛВE PC760,0952,380,0796Холестерин386,742,860,0331DSPE–PEG20002805,054,710,0264pNP–PEG3000–lipid34000,050,0003Σ =0,1395Измерение размера частиц в полученных иммунолипосомальныхкомпозициях производили методом динамического светорассеяния.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
