Диссертация (1141381), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Опытпроизводился при условиях, сходных с описанными в пункте 4.1. Данный опытпроизводился также с целью исключить влияние цитотоксичности антител икомпонентовлипосомальнойструктурынарезультатыисследованийцитотоксичности при концентрациях менее 100 мкг/мл. Результаты исследованияпредставлены на Рисунке 34 и Рисунке 35. Согласно приведенным данным,иммунолипосомальная форма отличается по цитотоксичности, однако антитела неоказывают существенного влияния на цитотоксичность в концентрациях нижеразбавления в 4 раза, соответствующего концентрации препарата 250 мг/мл.Цитотоксичность антител при разведении 1/8 (125 мг/мл) составляет в среднемоколо 10%. Из чего следует, что липосомальная и иммунолипосомальнаякомпозициянеоказываетзначимогомикрограммовых концентрациях.влияниянацитотоксичностьв106Рисунок 34 – Цитотоксический эффект пустой липосомальной ииммунолипосомальной формы на клетках SK–BR–3, 48 ч.
инкубация.ч.инкубация.120Пустые липосомыSPC% Выживших клеток100ПустыеиммунолипосомыSPC8060ПустыеиммунолипосомыEPC4020Пустые липосомыEPC0разб 1/8разб 1/4разб 1/2н/рРисунок 35 – Цитотоксический эффект пустой липосомальной ииммунолипосомальной формы на клетках SK–BR–3, инкубация 1ч 4°C,отмывка, время инкубации 48 ч.120Пустые липосомыSPC% Выживших клеток100ПустыеиммунолипосомыSPC8060ПустыеиммунолипосомыEPC4020Пустые липосомыEPC0разб 1/8разб 1/4разб 1/2н/р1074.3 Исследование цитотоксической активностииммунолипосомальной формы митоксантрона на клетках мишенях.Исследование цитотоксической активности производилось в условиях,сходных, с описанными в пункте 4.1.
Цитотоксический эффект оценивали наклетках линии SK–BR–3, имеющих рецепторы к антителам HER–2 neu.Результаты представлены на Рисунке 36, Рисунке 37 и Рисунке 38. Изприведенных данных следует, что иммунолипосомальные формы обладаютзначительно меньшей (в среднем на 38%) цитотоксичностью, чем субстанциямитоксантрона. Данные результаты соотносятся с результатами исследованияцитотоксичности,полученнымидляиммунолипосомальногоHER-2доксорубицина на клеточной линии SK-BR-3, где цитотоксичность липосом ииммунолипосомбылапрепарата[221].Кромезначительнотого,нижецитотоксичностилипосомальныеисвободногоиммунолипосомальныеконструкции не имеют существенных различий при проведении МТТ теста безотмывки, однако при отмывке после инкубации на холоду цитотоксичностьиммунолипосомальных форм выше на 10 %.
Данный факт связан, прежде всего, стем, что специфичные иммунолипосомы в отличие от липосом способныреагировать с поверхностными антигенами клеток – мишеней и оказыватьцитотоксический эффект. Также было показано, что иммунолипосомальнаялекарственная форма на основе соевого фосфатидилхолина обладает большейцитотоксичностью по отношению к клеткам мишеням, чем липосомальныеформы.
Рисунок 38. Общий прирост цитотоксичности по отношению к обычнымлипосомам составляет в среднем около 20%. В свою очередь, иммунолипосомы наоснове яичного фосфатидилхолина не проявили подобного эффекта. Дляиммунолипосомальнойлекарственнойформынаосновесоевогофосфатидилхолина было определено значение ингибирующей концентрацииИК50=75 мкг/мл. Также данный показатель был определен для субстанциимитоксантрона ИК50=7,6 мкг/мл.108Рисунок 36 – Цитотоксический эффект иммунолипосомальных форммитоксантрона и субстанции на клетках SK–BR–3, время инкубации 48 ч.100% Выживших клеток9080Митоксантрончистый70ИммунолипосомыE-PC60ИммунолипосомыSPC-35040306,2512,52550100Концентрация препарата (мкг/мл)% Выживших клетокРисунок 37 – Цитотоксический эффект иммунолипосомальных форммитоксантрона и субстанции на клетках SK–BR–3, инкубация 1ч 4°C,отмывка, время инкубации 48 ч.1009080706050403020100МитоксантрончистыйИммунолипосомыE-PCИммунолипосомыSPC-36,2512,52550100Концентрация препарата (мкг/мл)109Рисунок 38 – Цитотоксический эффект иммунолипосомальных форммитоксантрона, липосомальных форм и субстанции на клетках SK–BR–3,инкубация 1ч 4°C, отмывка, время инкубации 48 ч.10090Митоксантрон чистый% Выживших клеток8070Иммунолипосомы E-PC6050Иммунолипосомы SPC-34030Липосомы EPC20Липосомы SPC-31006,2512,52550100Концентрация препарата (мкг/мл)Оценкапроизводласьспособностискпомощьюсвязываниюполученыхиммунолипосомнепрямойреакцииповерхностнойиммунофлюоресценции.
В качестве клеток–мишеней использовались клеткилинии SK–BR–3. Подробное описание метода содержится в Главе 2 (пункты2.3.13). С помощью МКА к HER–2 neu было выявлено 96,7% связываниеиспользуемых антител с клетками – мишенями Рисунок 39.
В качестве контроляиспользовалисьнеокрашенныеклеткииклетки,инкубированныеслипосомальной формой митоксантрона Рисунок 40. При инкубировании клетокSK–BR–3 с иммунолипосомальной конструкцией митоксантрона наблюдалосьсвязывание с 95,3% клеток, что свидетельствует о высокой специфичностиполученной ИЛЛФ по отношению к клеткам – мишеням Рисунок 41.110Рисунок 39 – Анализ специфического связывания HER–2 neu склетками SK–BR–3 методом проточной цитофлуориметрии (антитела вразведении 1:500).Рисунок 40 – Контроль анализа специфического связывания HER–2neu с клетками SK–BR–3 методом проточной цитофлуориметрии (клеткиинкубированные с липосомальной формой митоксантрона (справа) инеокрашенные клетки (слева)).Рисунок 41 – Анализ специфического связывания HER–2 neu склетками SK–BR–3 методом проточной цитофлуориметрии(иммунолипосомы с митоксантроном).1114.4 ЗаключениеИсследованиецитотоксическойактивностилипосомальнойформымитоксантрона в 48 часовой инкубации показало ее более низкую активность поотношению к субстанции препарата на клетках линии SK–BR–3, что может бытьсвязано с недостаточным проникновением препарата в клетку по причинестерической стабилизации липосомальных наночастиц.Исследованиецитотоксическойактивностипустыхиммунолипосомпоказало, что антитела, закрепленные на их поверхности не оказываютсущественного влияния на цитотоксический эффект.
При разбавлении 1/8 (125мг/мл) они вызывают гибель только 10% клеток, что говорит о том, что висследуемыхдиапазонах(менее200мкг/мл)липосомынеоказываютсамостоятельного цитотоксического эффекта.Исследованиецитотоксичесическогодействияиммунолипосомальныхкомпозиций также показало их значительно меньшую эффективность in vitro поотношению к субстанции препарата, однако у композиции, состоящей из S PC–3 вкачестве основного компонента, цитотоксичность значимо отличалась отаналогичной липосомальной формы в среднем на 20% в диапазоне концентрацийот 25 до 100 мкг/мл. ИК50 для S PC–3 ИЛКМ составило 75 мкг/мл,соответствующая ИК50 для митоксантрона при этом составила 7,5 мкг/мл.Исследованияспецифическогосвязыванияиммунолипосомальныхконструкций показало, что используемая технология изготовления не влияет наактивность антител (95,3%клеток связывалось с иммунолипосомальнойконструкцией, связывание с контролем при этом составило 96,7%).112Выводы1.
Разработан состав и оптимальный метод изготовления стерическистабилизированных липосомальных дисперсий митоксантрона на основенасыщенного соевого фосфатидилхолина со средним диаметром 105±6нм. Для липосом на основе насыщенного соевого фосфатидилхолинаподобраны оптимальные условия загрузки(1,5 часа при температуре45°C). Процент включения препарата составил 96,9±3%2. Разработан состав и оптимаьный метод изготовления стерическистабилизированных иммунолипосомальных конструкций митоксантронас МКА к HER-2 neu на основе насыщенного соевого фосфатидилхолинасо средним диаметром 109±6 нм и процентом включения 96,9±3%.Среднее количество антител на 1 липосому составило ~ 20.3.
Разработана методика изготовления стерически стабилизированныхиммунолипосомальных конструкций митоксантрона с МКА к HER-2 neuна основе яичного фосфатидилхолина со средним диаметром 147±8 нм ипроцентом включения 95±3%. Среднее количество антител на 1липосому составило ~ 20.4. Отработана методика количественного определения митоксантрона вИЛЛФ и ЛЛФ митоксантрона на основе соевого фосфатидилхолинаметодом спектрофотометрии при аналитической длине волны 242±2нм.5.
Отработана методика лиофильной сушки ЛЛФ и ИЛЛФ митоксантронана основе насыщенного соевого фосфатидилхолина. Оптимальнымкриопротекторомдляпроцедурылиофилизациилипосомальныхконструкций митоксантрона был выбран 10% раствор сахарозы. Размерчастиц после лиофилизации увеличился на 9 – 12 нм. Содержаниемитоксантрона в ресуспендируемых везикулах составило 77-79% напротяжении шести месяцев хранения ЛЛЛФ в морозильной камере притемпературе −18°C.1136. Было проведено исследование цитотоксической активности ЛЛФ иИЛЛФ митоксантрона на клетках линии SK-BR-3 при 48 часовойинкубации.
ИК50 для S PC-3 ИЛКМ составило 75 мкг/мл.7. Исследованияспецифическогосвязыванияиммунолипосомальныхконструкций показало, что используемая технология изготовления невлияет на активность антител и МКА к HER-2 neu сохраняют своюспецифичность.8. РазработаныпроектыФСПна«Митоксантронлипосомальныйлиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2мг» и«Митоксантрон иммунолипосомальный лиофилизат для приготовленияраствора для инъекций 2мг».114СПИСОК СОКРАЩЕНИЙAUC – площадь под кривойBP – британская фармакопеяCD – кластер дифференцировкиChol – ХОЛ –холестеринChol – холестеринCYP 450– цитохромы P 450DMPC – димиристоил фосфатидилхолинDMPC – димиристоилфосфатдилхолинDMPG – димиристоил фосфатидилглицеролDOPC – диолеоил фосфатидилхолинDOTAP - 1,2-диолеил-3-триметиламмоний-пропанDPPC – дипалмитоилфосфатидилхолинDPPG – дипальмитоил фосфатидилглицеролDSPC – дистеароилфосфатидилхолинDSPG – дистеароил фосфатидилглицеролE–PC – яичный фосфатидилхолинEPG – яичный фосфатидилглицеролEur.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
