Диссертация (1141381), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Среднийпроцент включения препарата после лиофилизации составлял для трехисследуемых партий препарата 78,57±0,69 % , средняя утечка препарата прилиофилизации составила 18,12±1% , а утечка в процессе хранения в течениешести месяцев в морозильной камере при температуре -18°C составила не более1%Таблица18.МетрологическиехарактеристикиЭффективность включения, %МетрологическиехарактеристикиСодержаниеМитоксантрона в Липосомах,мгПартия препаратаСрок хранения, месяцевОптическая плотность, Iфр96,910,10560,32510,14540,21740,2243%97,1696,6896,9997,2796,500,96910,000010,00330,00150,0000220,0023%0,97160,96670,96980,97270,964900,55580,55300,55480,55640,552079,460,11880,34480,15420,24450,3078%79,0979,6279,9779,4279,230,79460,000010,00340,00150,0000240,0031%0,79080,79620,79960,79420,792302031530,41280,41560,41740,41460,413679,360,10070,31740,14190,20710,2610%79,6779,0779,7579,2479,120,79370,000010,00320,00140,0000210,0026%0,79660,79060,79740,79230,791160,41590,41270,41630,41360,413096,200,379350,61590,27540,78040,8112%96,8296,0596,6996,2195,270,96200,000030,00620,00280,0000790,0082%0,96820,96040,96690,96210,952600,56350,55900,56280,56000,554578,180,17300,41590,18600,35590,4552%78,2477,7278,2278,8377,930,78190,000010,00420,00190,0000360,0046%0,78240,77720,78220,78830,779310031530,40840,40570,40830,41150,406877,900,25530,50530,22600,52530,6743%78,3478,2878,4877,8777,580,77910,000020,00510,00230,0000530,0067%0,78340,77280,78480,77870,775860,40890,40340,40970,40650,404997,280,133670,36560,16350,27500,2827%96,9697,2096,9497,7697,560,97280,000010,00360,00160,0000270,0028%0,96950,97190,96940,97750,975600,55460,55600,55450,55920,5581Таблица 18 Количественное определение Митоксантрона в лиофилизированных партиях78,380,11960,34600,15470,24620,3141%78,7978,2278,7278,1278,060,78380,000010,00350,00150,0000250,0031%0,78790,78220,78720,78120,780616031530,41130,40830,41090,40780,407578,180,14300,37820,16910,29420,3763%78,6878,4878,0277,9777,790,78190,000010,00380,00170,0000290,0038%0,78680,78480,78010,77970,777860,41070,40970,40720,40700,4060991003.7 ЗаключениеПолучено 3 модели липосомальной формы митоксантрона на основесоевого фосфатидилхолина и 1 модель на основе яичного фосфатидилхолинаИсследование среднего диаметра МЛВ на приборе Submicron Particle SizerNICOMP 380, показало влияние различных липидных составов на размерполученных липосом.
Наиболее оптимальные результаты были достигнуты длясоставов №3 и №4, 479± 58 и 421± 79 соответственно.Отработана методика получения МОЛ на основе насыщенного соевогофосфатидилхолина методом экструзии при температуре 55 °С.При анализе размеров полученных дисперсий МОЛ получены следующиеданные: Для составов на основе S PC–3: №1(101±5 нм), №2(117±8 нм), №3(105±6нм) и E–PC №4(145±7 нм).Показано что состав МЛВ влияет на размеры дисперсии МОЛ послеэкструзии.Подобраны оптимальные условия загрузки для дисперсий МОЛ на основесоевого фосфатидилхолина.
(1,5 при температуре 45°C и 12ч при температуре4°C)Показано, что состав липидной композиции влияет на загрузку МОЛ наосновесоевогомодифицированнымфосфатидилхолинаметодом.Количествосубстанциейвключенногомитоксантронавлипосомымитоксантрона составляло для композиций на основе соевого фосфатидилхолина№1и №2, 85,6% и 94,9% соответственно, для композиции №3 96,9%.Согласноданным,полученнымприисследованиилипосомальныхкомпозиций на основе насыщенного соевого фосфатидилхолина, оптимальнымсоставом для получения МОЛ стал состав № 3 с соответствующими мольнымисоотношениями в моль% (60:39,5:0,5).Для композиции №3 на основе соевого фосфатидилхолина оптимальноемассовое соотношение митоксантрона к липиду составило 0,12:1. Было выявлено,101что дальнейшее увеличение количества включаемого препарата вызываетснижение процента включения митоксантрона.Разработана технология получения иммунолипосомальных конструкциймитоксантрона с МКА против HER–2 neu.
Для получения иммунолипосомиспользовалинасыщенныйсоевыйфосфатидилхолин(SPC–3),яичныйфосфатидилхолин (E–PC), холестерин, mPEG2000–DSPE и pNP–PEG3000–lipid. Длясозданияиммунолипосомальныйконструкцийиспользовалисьследущиекомпозиции липидов в моль% S PC–3: Холестерин: DSPE – PEG–2000: pNP–PEG3000–lipid (60:39,5:0,45:0,05), E PC: Холестерин: DSPE – PEG–2000: pNP–PEG3000–lipid (52,38:42,86:4,71:0,05). Загрузку композиций производили сиспользованием градиента сульфата аммония. Степень включения препарата влипосомы составила ≈ 96,9% и ≈ 94,1% для S PC–3 ИЛКМ и E PC ИЛКМсоответственно.
Среднее количество молекул антител на 1 липосому составило ~20.Приспектрофотометрическихисследованияхбыловыявлено,чтовспомогательные вещества из состава иммунолипосом на основе соевогофосфатидилхолинаиМКАнесоздавалисущественныхпомехдляколичественного определения препарата в иммунолипосомах при аналитическойдлине волны 242±2нм.Отработана методика лиофильной сушки липосомальной конструкциимитоксантронанаосновесоевогофосфатидилхолина.Оптимальнымкриопротектором для липосомальной конструкции и иммунолипосомальнойконструкции митоксантрона на основе соевого фосфатидилхолина был выбранраствор сахарозы 10%.Были исследованы различные методы заморозки липосомальной дисперсии.При различных способах замораживания размеры липосомальных частицпрактически не отличались, также различные способы заморозки не оказализначительного влияния на утечку препарата из липосом.
Однако способмедленной заморозки показал незначительно более высокие показатели по102размерам частиц и проценту включения препарата в ресуспендированныхлипосомах.Средняяэвтектическаятемпературадлярастворалипосомальнойдисперсии составила – 10±3°C.Изучение влияния процесса сублимационной сушки на геометрическиехарактеристики частиц показало, что размер частиц после лиофилизациинезначительно увеличивался в пределах 9–12 нм в зависимости от сериипрепарата.Анализ эффективности инкапсулирования митоксантрона в липосомыпоказал, что содержание митоксантрона в ресуспендируемых везикулах неменялось и составило 77-79 % на протяжении шести месяцев хранениялиофилизированной липосомальной дисперсии в морозильной камере притемпературе −18°C.
При этом средняя утечка при лиофилизации составила18,12±1%, а утечка препарата в процессе хранения составила не более 1%.103ГЛАВА 4.Исследование липосомальной и иммунолипосомальнойлекарственной формы препарата in vitroЦитотоксическую активность липосомальной и иммунолипосомальнойформы митоксантрона двух липидных составов: на основе насыщенного соевогофосфатидилхолина и на основе яичного фосфатидилхолина, оценивали спомощью МТТ – теста на линии клеток SK–BR–3. Составы липосомальной ииммунолипосомальной формы митоксантрона описаны в Главе 3 (пункты 3.1. и3.3.).4.1 Исследование цитотоксической активности липосомальнойформы митоксантрона на клетках мишенях.Цитотоксическуюактивностьлипосомальнойлекарственнойформымитоксантрона в исследованиях in vitro оценивали двумя методами: с отмывкойпосле инкубации при 4 °C в течение часа и без отмывки.
Отмывка производиласьс целью определения специфического действия и биодоступности частиц, такимобразом в среде оставались только компоненты, успевшие провзаимодействоватьс клетками-мишенями в период первичной часовой инкубации. В экспериментеизучалась активность субстанции митоксантрона, и липосомальных форммитоксантрона различного состава при концентрациях 6,25, 12,5, 25, 50 и 100мкг/мл. Гибель клеток определялась после инкубации в течение 48 ч. Результатыопытов представлены на Рисунке 32 и Рисунке 33.104Рисунок 32 – Цитотоксический эффект липосомальных форммитоксантрона и субстанции на клетках SK–BR–3, время инкубации 48 ч.% Выживших клеток100908070Митоксантрон чистый60Липосомы EPC50Липосомы SPC-340306,2512,52550100Концентрация митоксантрона (мкг/мл)% Выживших клетокРисунок 33 – Цитотоксический эффект липосомальных форммитоксантрона и субстанции на клетках SK–BR–3, инкубация 1ч 4°C,отмывка, время инкубации 48 ч.1008060Митоксантрон чистый40Липосомы EPC20Липосомы SPC-306,2512,52550100Концентрация митоксантрона (мкг/мл)Из данных, приведенных выше следует, что липосомальные лекарственныеформы проявляют меньшую цитотоксичность, чем раствор субстанции всоответствующих концентрациях в среднем на 30 – 40%.
Данный факт преждевсего связан с более медленным проникновением липосомальных препаратов вклетку по причине их стерической стабилизации. Свободно растворенный в средемитоксантрон быстрее захватывается клетками мишенями и оказывает на нихсвое цитотоксическое действие. В то же время, липосомальные лекарственныеформы на основе E PC и S PC–3 не имеют между собой значимых различийцитотоксичности на клетках линии SK–BR–3 при инкубировании с отмывкой, что105говорит о их эквивалентной биодоступности для клетки-мишени.
Однако стоитотметить, что при инкубации в малых концентрациях (6,25 мкг/мл) безпроведенияотмывкифосфатидилхолиналипосомыпоказалинабольшуюосновенасыщенногоцитотоксичностьвсоевогосравнениислипосомами на основе яичного фосфатидилхолина в среднем на 10%.4.2 Оценка влияния пустых иммунолипосомальных илипосомальных конструкций на цитотоксичность.Для оценки влияния антител, закрепленных на поверхности липосом илипосомальнойструктурынацитотоксичность,производиласьоценкацитотоксичности пустых липосом и иммунолипосом в различных разведениях. Вкачестве образца для исследования, были использованы иммунолипосомы илипосомы на основе яичного и насыщенного соевого фосфатидилхолина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
