Диссертация (1141376), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Получили оптимизированные графики (припостроении графиков учитывали значения степени гемолиза, находящиеся вдиапазоне от 0,15 до 0,85; значения, находящиеся за пределами указанногодиапазона не учитывали), соответствующие нанесенным точкам.Рисунок 6 – Графики линейного участка гемолиза в контроле комплемента,положительном и отрицательном контроле стандартного образцаиммуноглобулина человека BRPКоэффициент корреляции для графика линейного участка гемолиза, долженбыть более 0,95 [68], а также тангенс наклона прямой должен быть между 0,15 и0,40, предпочтительно в интервале 0,18-0,30 [49].Графикилинейногоучасткагемолизавконтролекомплемента,отрицательном и положительном контролях СО иммуноглобулина человека BRPпредставлены на Рисунке 6.
Полученные графики имеют коэффициентыкорреляции более 0,99 и тангенсы наклона прямых в интервале от 0,2131 до0,2177, что удовлетворяет критериям приемлемости.Диапазон применения задан в самой методике определения АКА –контроль комплемента должен содержать от 80 до 120 СН50/мл. При проведениивалидационных исследований активность комплемента в контроле комплементанаходилась в диапазоне от 80,5 до 115,3 СН50/мл.803.3. Определение требований к стандартному образцу для определенияантикомплементарной активностиС целью определения требований были выделены следующие основныехарактеристики СО для определения АКА: значения АКА, содержание белка,форма выпуска.Целью использования отрицательного контроля СО при определении АКАявляется получение значений, укладывающихся в нормативные требования,предъявляемые к ЛП ИГВВ, т.е.
не более 50 %. Соответственно цельюиспользования положительного контроля СО является получение значений,находящихся свыше 50 %. СО иммуноглобулина человека BRP серия 1 имеетаттестованные значения АКА отрицательного контроля, находящиеся в диапазонеот 10 до 40 %, положительного контроля – от 60 до 100 %. Указанные диапазоныконтролейполученыэкспериментальнымпутемвпроцессеаттестацииконкретной серии кандидата в СО иммуноглобулина человека BRP.Аттестация положительного и отрицательного контролей СО в указанныхинтервалах подтверждает достоверность полученных результатов в различныхдиапазонах значений АКА.СО иммуноглобулина человека BRP представляет собой лиофильновысушенныйиммуноглобулинчеловека,которыйпередиспользованиемрастворяют в заданном объеме (105,4 мл) воды очищенной. В результатеполучают раствор с содержанием иммуноглобулина примерно 50 мг/мл, при этомвозникает необходимость подтверждения содержания белка в полученномрастворе.Для определения АКА ЛП ИГВВ берут фиксированное количествоиммуноглобулина (10 мг), содержащееся в объеме не более 0,8 мл, следовательно,содержание белка иммуноглобулина в образце должно быть не менее 12,5 мг/мл.ВслучаеиспользованиядвухкомпонентногоСОсодержаниеотрицательном и положительном контроле должно быть одинаковым.белкав81Для рациональности использования положительный и отрицательныйконтроли должны представлять собой раствор иммуноглобулина человека видентичной форме выпуска (раствор иммуноглобулина человека в ампулах от 1до 5 мл).
Форма выпуска в виде раствора предпочтительнее лиофилизата, т.к. приаттестациилиофилизатапосодержаниюбелкапроисходитувеличениепогрешности (неопределенности) аттестуемой характеристики.Таким образом, СО для определения АКА должен соответствоватьследующим требованиям:1. Значения АКА отрицательного контроля должны составлять менее 50 %;положительного контроля более 50 % (с учетом биологического референтногоинтервала, считали приемлемыми значения менее 47,5 % и более 52,5 %соответственно).2. Содержание белка в отрицательном и положительном контролях должнобыть одинаковым и составлять не менее 12,5 мг/мл.3.
Положительный и отрицательный контроли должны представлять собойраствор иммуноглобулина человека в идентичной форме выпуска (раствориммуноглобулина человека в ампулах от 1 до 5 мл).3.4. Выбор кандидата в стандартный образец для определенияантикомплементарной активностиВыбор кандидата в СО для определения АКА осуществлялся по средствамизученияантикомплементарныхсвойствразличныхиммуноглобулинов человека отечественного производства.препаратов823.4.1. Изучение возможности использования лекарственных препаратовиммуноглобулинов человека для внутривенного введения в качествекандидата в стандартный образец для определения антикомплементарнойактивностиВ целях разработки СО для определения АКА проводились исследования понескольким направлениям.
Первоначально была проведена оценка возможностииспользования препаратов ИГВВ отечественного производства в качестве СО.При этом отрицательный и положительный контроли формировались путемизменения исходного количества иммуноглобулина (0,2 мл для отрицательногоконтроляи0,6млдляположительногоконтроля)аналогичноСОиммуноглобулина человека BRP. Были изучены по три серии различныхлекарственных форм ИГВВ отечественного производства (Таблица 10).Таблица 10 – Антикомплементарнаяактивностьлекарственныхпрепаратовиммуноглобулинов человека для внутривенного введенияАнтикомплементарная активность, процент,Иммуноглобулин человека№ образца/нормальный в лекарственнойколичествоформеисследованийЛиофилизат для приготовления1/615,7±3,3раствора для внутривенного2/519,4±3,8введения3/722,3±5,81/412,0±2,22/413,0±1,83/422,2±6,41/320,1±3,82/522,4±1,73/424,2±5,2Раствор для внутривенноговведенияРаствор для инфузий± SxОтрицательныйПоложительныйконтрольконтрольПримечание – * – минимальная степень гемолиза превышает 50 %Определитьневозможно*Определитьневозможно*Определитьневозможно*83Результаты исследований свидетельствуют о возможности использованияизученных ЛП ИГВВ в качестве отрицательного контроля и их непригодность вкачестве положительного контроля СО для определения АКА (минимальнаястепень гемолиза превышала 50%).3.4.2.
Изучение возможности использования лекарственных препаратовиммуноглобулинов человека для внутримышечного введения в качествекандидата в стандартный образец для определения антикомплементарнойактивностиПо мнению ряда исследователей [82, 91, 99, 110], одним из факторов,обусловливающих спонтанную активацию комплемента, является присутствие вЛПагрегированныхиповрежденныхприфракционированиимолекулиммуноглобулина.
Нормативными требованиями к ЛП ИГВМ регламентированоповышенное содержание агрегированных молекул иммуноглобулина (до 10 %).В связи с этим, на втором этапе была изучена возможность использованияпрепаратов ИГВМ в качестве положительного контроля СО для определенияАКА. С этой целью были исследованы образцы 17 серий препаратов ИГВМ(Таблица11),полученныерезультатысвидетельствуетонепригодностииспользования изученных ЛП в качестве кандидата в положительный контроль ивозможности их применения в качестве отрицательного контроля СО дляопределения АКА.84Таблица 11 – Антикомплементарнаяактивностьлекарственныхпрепаратовиммуноглобулинов человека для внутримышечного введенияГруппировочное наименованиелекарственного препарата№ образцаЗначения антикомплементарнойактивности, процент, ± Sx, n=3Иммуноглобулин человека143,2±1,4противостафилококковый237,4±5,1Иммуноглобулин человека140,5±1,1противостолбнячный234,7±0,8143,0±1,3242,5±1,6Иммуноглобулин человека341,0±1,9нормальный440,5±2,1539,9±2,4640,9±1,8Иммуноглобулин человека против132,6±4,8гепатита В235,2±3,3Иммуноглобулин человека129,5±2,3противоаллергический233,4±1,5141,0±1,5242,4±1,9340,7±1,8Иммуноглобулин против клещевогоэнцефалитаС целью выяснения возможных причин получения таких результатов, намибыл проведен ретроспективный анализ молекулярно-массового распределениямолекул иммуноглобулина в 330 сериях ЛП ИГВМ (Таблица 12), которыйпозволил сделать вывод о том, что содержание полимеров и агрегатов во всехисследованных сериях не превышает 1,32 % и соответствует требованиям,предъявляемым ЕФ и ФС «Иммуноглобулин человека нормальный длявнутривенного введения» к содержанию данных компонентов в инфузионных ЛПиммуноглобулинов человека – не более 3 % [34, 66, 89].85Таблица 12 – Молекулярно-массовое распределение молекул иммуноглобулина влекарственныхпрепаратахиммуноглобулиновчеловекадлявнутримышечного введенияГруппировочное наименованиелекарственного препаратаИммуноглобулин человекапротивостолбнячныйИммуноглобулин человека противгепатита ВИммуноглобулин человека нормальныйИммуноглобулин человекапротивостафилококковыйИммуноглобулин против клещевогоэнцефалитаИммуноглобулин человекапротивоаллергическийКол-во серийДиапазон значений содержанияполимеров и агрегатов, процент13От 0,06 до 0,869От 0,09 до 1,04110От 0,00 до 0,9846От 0,00 до 0,56131От 0,00 до 1,3221Отсутствуют3.4.3.
Изучение возможности использования подвергшихся нагреваниюлекарственных препаратов иммуноглобулинов человека в качествекандидата в положительный контроль стандартного образца дляопределения антикомплементарной активностиДальнейшие исследования по разработке СО были направлены наповышение АКА иммуноглобулинов человека до значений, приемлемых дляположительного контроля. На основании имеющихся литературных данных [126],при термической обработке (температура более 50 ºС) иммуноглобулинапроисходит увеличение АКА, что, по-видимому, связано с конформационнымиизменениями молекул белка [60].86Для выбора оптимального времени прогревания на водяной бане притемпературе 56±1 °С образцов ЛП ИГВВ/ИГВМ до получения значений АКА,удовлетворяющих требованиям к положительному контролю СО:– ампулы по 1,0 и 1,5 мл с образцами ЛП иммуноглобулина человекаподвергали термической обработке на водяной бане при температуре воды56±1 °С в течение 3, 5 и 7 мин с последующим охлаждением при комнатнойтемпературе в течение 15 мин;– ампулы по 3,0 и 3,4 мл с образцами ЛП иммуноглобулина человекаподвергали термической обработке на водяной бане при температуре воды56±1 °С в течение 5, 7 и 10 мин с последующим охлаждением при комнатнойтемпературе в течение 15 мин;– флаконы по 25,0 мл с образцами ЛП иммуноглобулина человекаподвергали термической обработке на водяной бане при температуре воды56±1 °С в течение 10, 15 и 20 мин с последующим охлаждением при комнатнойтемпературе в течение 20 мин.В Таблице 13 представлены результаты исследований АКА образцов ЛПиммуноглобулинов человека до и после термической обработки, позволяющиесделать вывод о том, что кратковременное прогревание образцов приводит кувеличению значений их АКА до диапазона, превышающего 50 % (соответствуеттребованиям, предъявляемым к положительному контролю).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
