Диссертация (1141376), страница 10
Текст из файла (страница 10)
с критической величиной t (степеньдостоверности 95 %) сделали вывод о значимости различий между величинамиАКА, измеренными с и без корректировки исходного значения рН ЛП ИГВВ.Результаты, полученные в настоящем исследовании, продемонстрировализначительноевлияниеисходногозначениярНисследуемыхобразцовиммуноглобулина на конечный результат определения АКА. Таким образом,более детальное изучение данной проблемы должно быть проведено каждымпроизводителем в ходе валидационных исследований по определению АКА [35].3.1.2. Изучение влияния комплемента морских свинок на результатопределения антикомплементарной активностиНа конечный результат определение АКА лекарственных препаратов ИГВВсущественное влияние оказывает гемолитическая активность используемого64комплемента морских свинок. Различные партии комплемента морских свинокдемонстрируют различные значения АКА для одного и того же образца ЛПИГВВ.
Кроме того, как следует из данных литературы, степень гемолиза можетзначительно отличаться при использовании различных серий комплемента [82,144].В исследованиях проведенных Buchacher и соавт. (2010) [82] было показано,что подходящие серии комплемента должны быть определены в процедурескрининга.С учётом вышеизложенного нами было проведено изучение влиянияразличных серий и источников получения комплемента морских свинок нарезультат определения АКА по методике ЕФ.Приизучениивлияниякомплементаморскихсвинокразличныхпроизводителей (два коммерческих комплемента и пулированный комплемент (inhouse) собственного изготовления) установили, что только при использованиипулированного комплемента (in house) значения АКА СО иммуноглобулиначеловека BRP серии 1 соответствуют аттестованным (Таблица 5).Оценка АКА ЛП иммуноглобулина человека нормального в различныхформах выпуска по методике ЕФ, свидетельствовала о том, что для всехисследованныхобразцовнаибольшиезначенияАКАполученыиспользовании пулированного комплемента (in house) (Таблица 6).приТаблица 5 – АнтикомплементарнаяактивностьстандартногообразцаиммуноглобулиначеловекаBRPприиспользовании комплемента морских свинок различных производителейНаименование реагента/производительКомплемент сухой/ ФГУП«НПО «Микроген» МинздраваРоссииCOMPLEMENT/ SiemensПулированный комплемент/ inhouseАнтикомплементарная активность СОСоответствие аттестованным значениямСерия реагентаиммуноглобулина человека BRP, процент,антикомплементарной активности СО(количествох ±Sxиммуноглобулина человека BRPисследований)ОтрицательныйПоложительныйОтрицательныйПоложительныйконтрольконтрольконтроль*контроль**785 (n=6)8,5±2,214,6±3,7НетНет806 (n=5)13,4±1,7ДаНет811 (n=9)11,6±2,5Определитьневозможно***36,4±5,9НетНет814 (n=8)11,5±3,132,2±5,3НетНет42178 (n=7)14,2±2,836,3±5,2ДаНет42794 (n=10)13,6±2,640,1±4,6ДаНет24.10.13 (n=8)18,8±3,479,5±2,4ДаДа21.01.14 (n=12)18,5±2,984,0±4,1ДаДа15.06.15 (n=7)20,9±2,476,6±2,5ДаДаПримечания.*– аттестованные значения составляют от 10 до 40 %;**– аттестованные значения составляют от 60 до 100 %;***– минимальная степень гемолиза превышает 50 %.Таблица 6 – Антикомплементарнаяактивностьлекарственныхпрепаратовиммуноглобулиновчеловекадлявнутривенного введенияАнтикомплементарная активность лекарственных препаратовиммуноглобулина человека нормальногоНаименование реагента/производительраствор для внутривенного введенияСН50/мг белка,х ±SxКомплемент сухой/ ФГУП «НПО«Микроген» Минздрава РоссииCOMPLEMENT/ SiemensПулированный комплемент/in houseпроцент, х ±Sxлиофилизат для приготовленияраствора для внутривенного введенияраствор для инфузийСН50/мг белка,процент,СН50/мг белка,х ±Sxх ±Sxх ±Sxпроцент, х ±Sx0,06±0,053,3±2,10,10±0,065,1±3,20,44±0,0421,9±2,1(n=33)(n=33)(n=12)(n=12)(n=3)(n=3)0,18±0,078,9±3,50,23±0,0611,6±3,20,42±0,1220,8±5,9(n=9)(n=9)(n=16)(n=16)(n=10)(n=10)0,36±0,0917,9±4,40,42±0,1320,8±6,40,61±0,1730,4±8,6(n=57)(n=57)(n=74)(n=74)(n=26)(n=26)Примечание – n – количество исследованных серий лекарственного препаратаРезультаты исследования, представленные в Таблице 6, свидетельствуют отом, что значения АКА лекарственного препарата «Иммуноглобулин человеканормальный, раствор для внутривенного введения», определенные по методикеЕФ с использованием пулированного комплемента (in house), в 6 раз превышаютзначения АКА при использовании указанной методики с набором реагентов«Комплемент сухой», производства ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава Россиии в 2 раза выше, чем при использовании комплемента производства «Siemens».Длялекарственноголиофилизатдляпрепаратаприготовления«Иммуноглобулинрастворадлячеловеканормальный,внутривенноговведения»превышения значений АКА составили 4,2 и 1,8 раза соответственно.
Длялекарственного препарата «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор дляинфузий» превышения значений АКА составили 1,4 и 1,5 раза соответственно.Анализ паспортных данных лекарственного препарата «Иммуноглобулинчеловека нормальный, раствор для внутривенного введения» позволил сделатьвывод о том, что значения АКА (х ±Sx), полученные в методике МУК 3.3.2.106301, составляют 0,0±0,0 СН50/мг белка (n=110), что ставит под сомнениетерапевтическую эффективность ЛП. Однако в проведенных исследованиях сиспользованием пулированного комплемента (in house) по методике ЕФ полученызначения, равные 0,36±0,09 СН50/мг белка (n=57).Анализ паспортных данных лекарственного препарата «Иммуноглобулинчеловеканормальный,лиофилизатдляприготовлениярастворадлявнутривенного введения» позволил сделать вывод о том, что значения АКА (впроцентах) (х ±Sx), полученные в методике МУК 3.3.2.1063-01, составляют4,7±2,6 % (n=143).
В настоящем исследовании с использованием пулированногокомплемента (in house) значения АКА указанного ЛП составили 20,8±6,4 %(n=74).Таким образом, использование сухого комплемента морских свинок всоответствии с методикой МУК 3.3.2.1063-01 не позволяет определятьдостоверный уровень АКА и ставит под сомнение значимость полученных68результатов для прогнозирования безопасности иммуноглобулинотерапии, чтообуславливает необходимость ее совершенствования [31].Методика определения АКА, применяемая большинством зарубежныхпроизводителей ЛП ИГВВ, предусматривает использование пулированногокомплемента собственного изготовления. В одном случае имеются указания овозможностииспользованиякоммерческогокомплемента,однако,приприменении следует проверить его активность и провести исследования поопределению АКА не менее чем на 5 образцах ЛП ИГВВ, исследованных ранее спомощью комплемента собственного изготовления.
Результаты не должнызначительно различаться по данным промежуточной прецизионности метода.Результаты настоящих исследований также подтверждают необходимостьиспользования пулированного комплемента морских свинок (in house) в методикеопределения АКА.3.1.3. Оценка возможности использования желатин-солевого раствора вкачестве альтернативы желатин-барбиталового буферного раствораПрименение барбитала и его натриевой соли в составе буферного раствораограниченонеобходимостьюсоответствующеголицензирования.РанееМетодическими рекомендациями [28] было предусмотрено использованиежелатин-солевого раствора (ЖСР) следующего состава: 8,50 г натрия хлорида;0,10 г кальция хлорида безводного; 0,04 г магния хлорида 6-водного; 1,00 гжелатина; воды очищенной до 1000 мл.Доводят рН раствора до 7,2-7,3 с помощью 0,1М раствора натриягидроксида.
Раствор используют свежеприготовленным.В настоящем исследовании обосновали возможность применения вметодике ЖСР. Критерием служило соответствие значений АКА отрицательного69и положительного контролей СО иммуноглобулина человека BRP аттестованным(n=9) (Рисунок 4).Рисунок 4 – Антикомплементарная активность положительного (АКА «+»)и отрицательного (АКА «–») контролей стандартного образца иммуноглобулиначеловека BRP при использовании желатин-солевого раствора (ЖСР) и желатинбарбиталового буферного раствора (ЖББР)Такимобразом,проведенныеисследованияпозволилиобосноватьоптимальные условия определения АКА ЛП ИГВВ, предусматривающиеиспользование эритроцитов из крови бараньей дефибринированной с цитратомнатрия,гемолитическойсывороткивсоответствующемразведении,пулированного комплемента морских свинок (in house) и желатин-солевогораствора, как альтернатива желатин-барбиталового буферного раствора.Оптимизированная методика послужила основой для разработки ОФС«Определение антикомплементарной активности лекарственных препаратов70иммуноглобулинов человека для внутривенного введения», вошедшей в составГосударственной фармакопеи РФ XIII издания (Приложение А) [49].Отличия разработанной фармакопейной методики от ранее используемойбольшинством отечественных производителей ЛП ИГВВ [52] состоят вследующем [37]:– изменен состав желатин-барбиталового буферного раствора;– предусмотрена возможность использование ЖСР, как альтернатива ЖББР;– использование в качестве комплемента приготовленного пула сывороткикрови не менее 10 морских свинок;– уменьшен объем реакционной смеси при титровании гемолизина,комплемента и определении АКА в исследуемом образце иммуноглобулина;– предусмотрено использование СО иммуноглобулина человека;– впервые введена формула расчета для выражения АКА в процентах;– скорректирована формула расчета АКА, выраженной в единицахкомплемента, связавшегося с 1 мг белка иммуноглобулина (СН50/мг белка).3.2.
Валидация оптимизированной методики определенияантикомплементарной активностиВалидацию методики определения АКА проводили согласно требованиямотечественных и зарубежных руководств по валидации аналитических методик [48,58, 67, 135]. По типу аналитической процедуры данная методика являетсяколичественным испытанием на примеси, поэтому при валидации оценивалиправильность,прецизионность),прецизионностьспецифичность,(повторяемость,пределвнутрилабораторнаяколичественногоопределения,линейность и диапазон применения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
