Диссертация (1141376), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Гармонизацияроссийских стандартов по контролю качества ЛП ИГВВ с международнымитребованиями, бесспорно, повысит конкурентоспособность отечественных ЛПИГВВ, что является одной из задач стратегии развития фармацевтическойпромышленности РФ на период до 2020 г.41ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. МатериалыВнастоящемисследованиииспользовалиследующиематериалы,стандартные образцы и лекарственные препараты.Стандартные образцы:СО иммуноглобулина человека (АКА и молекулярные параметры) BRPсерия 1 [Human immunoglobulin (ACA and molecular size)] BRP batch 1 (Кат.№ Y0001504),утвержденныйЕвропейскимдиректоратомпокачествулекарственных средств и здравоохранения, Франция (European Directorate for theQuality of Medicines, EDQM) в 2011 г.;Отраслевойстандартныйобразец(ОСО)содержаниябелкавиммуноглобулине ОСО 42-28-340-2013 и ОСО 42-28-340-2014 (аттестованноезначение содержания белка – (10,0±0,27) % при доверительной вероятности 0,95),ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.Лекарственные препараты иммуноглобулина человека для внутривенноговведения отечественного и зарубежного производства:«Имбиоглобулин», раствор для инфузий 50 мг/мл, производство ФГУП«НПО «Микроген» Минздрава России, филиалы в г.
Н.Новгород и г. Пермь,Россия.«Иммуновенин®»,лиофилизатдляприготовлениярастворадлявнутривенного введения, 50 мг/мл, производство ФГУП «НПО «Микроген»Минздрава России, филиал в г. Уфа, Россия.«Иммуноглобулин человека нормальный», раствор для внутривенноговведения 50 мг/мл, производство ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России,филиал в г. Н.Новгород, Россия.«Габриглобин®-IgG», раствор для инфузий 50 мг/мл, производства ЗАО«Иммуно-Гем» (ОГУЗ «Ивановская областная станция переливания крови»),Россия.42«Гамунекс», раствор для инфузий 100 мг/мл, производства ТалекрисБиотерапьютикс Инк, США.«Привиджен», раствор для инфузий 100 мг/мл, производства СиЭсЭлБеринг АГ, Швейцария.«Октагам», раствор для инфузий 50 мг/мл, производства ОктафармаФармацевтика Продуктионсгес м.б.Х., Австрия.«Октагам® 10 %», раствор для инфузий 100 мг/мл, производства ОктафармаФармацевтика Продуктионсгес м.б.Х., Австрия.Лекарственныепрепаратыиммуноглобулиначеловекадлявнутримышечного введения отечественного производства:«Иммуноглобулинчеловекапротивостолбнячный»,раствордлявнутримышечного введения, производство ФГУП «НПО «Микроген» МинздраваРоссии, филиал в г.
Пермь, Россия.«ИммуноглобулинчеловекапротивгепатитаВ»,раствордлявнутримышечного введения, производство ФГУП «НПО «Микроген» МинздраваРоссии, филиал в г. Пермь, Россия.«Иммуноглобулин человека нормальный», раствор для внутримышечноговведения, производство ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, филиалы вг. Пермь, г. Уфа, г. Томск, Россия.«Иммуноглобулинчеловекаантистафилококковый»,раствордлявнутримышечного введения, производство ФГУП «НПО «Микроген» МинздраваРоссии, филиал в г. Томск Россия.«Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита», раствор длявнутримышечного введения, производство ФГУП «НПО «Микроген» МинздраваРоссии, филиалы в г.
Пермь, г. Томск, Россия.«Иммуноглобулинчеловекапротивоаллергический»,раствордлявнутримышечного введения, производство ФГУП «НПО «Микроген» МинздраваРоссии, филиал в г. Нижний Новгород, г. Уфа, Россия.В исследованиях использовали реактивы/реагенты отечественного изарубежного производства.43Комплемент морских свинок:– коммерческий набор реагентов «Комплемент сухой», производства ФГУП«НПО «Микроген» Минздрава России, филиал в г. Пермь, Россия;– коммерческий реагент «Комплемент морской свинки для реакциисвязывания комплемента» (CFT COMPLEMENT), кат. № ORAY, производстваSiemens, Германия;– комплемент сыворотки крови морских свинок (in house), представляющийсобой пул сыворотки крови не менее чем от 10 морских свинок (собственногоизготовления).Методика приготовления комплемента морских свинок:Не менее чем от 10 здоровых морских свинок отбирали кровь кардиальнойпункцией, около 5-10 мл от одного животного в зависимости от массы тела.
Сборкровиосуществляливцентрифужныепробиркивместимостью50мл.Инкубировали в термостате при температуре 37,0±0,5 °С в течение 15 мин дополного образования сгустка.По окончании образования сгустка пробирки открыли и осторожно провелитонкой стеклянной палочкой (запаянным капилляром Пастеровской пипетки) повнутренним стенкам пробирки по окружности в верхнем слое крови дляотделения столбика сгустка от стенок пробирки. Пробирки поместили вхолодильник 5±3 °С на сутки.Сыворотку из нескольких пробирок сливали в новую центрифужнуюпробирку вместимостью 50 мл, придерживая сгусток стеклянной палочкой, ицентрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 мин при температуре 5±3 °С.После центрифугирования сыворотку разлили на аликвоты по 0,2 и 1,0 мл вмикропробирки вместимостью 0,5 и 1,5 мл соответственно.
Хранили полученныеаликвоты в морозильнике при температуре ниже минус 70 °С.Гемолитическая сыворотка (гемолизин):– коммерческийнаборреагентов«Сывороткадиагностическаягемолитическая жидкая», производства ФГУП «НПО «Микроген» МинздраваРоссии, филиал в г. Пермь, Россия;44– коммерческий реагент «Сыворотка диагностическая гемолитическаякроличья жидкая для РСК», кат. № 03.16, производства ЗАО «ЭКОлаб», Россия;– коммерческий реагент «Антисыворотка кролика к эритроцитам баранаАмбоцептор 6000» (CFT AMBOCEPTOR), кат.
№ ORLC, производства Siemens,Германия.Для приготовления 5 % суспензии эритроцитов барана использовали кровьбаранью дефибринированную с цитратом натрия, кат. № 50.98, производства ЗАО«ЭКОлаб», Россия.Желатин-вероналовый буфер (Gelatin veronal buffer), кат. № G6514,производства Sigma, США.Для получения положительного контроля СО для определения АКАиспользовали следующее оборудование:– баня водяная Julabo ED-19M (Julabo Labortechnik GmbH, Германия);– термометр технический стеклянный ТТМ (диапазон измерений от 0 до100 °С, ОАО «Термоприбор», Россия).Для определения АКА использовали следующее оборудование:– цифровой спектрофотометр PD-303S (Apel, Япония);– центрифуга многофункциональная 5810R (Eppendorf AG, Германия);– весы прецизионные Adventurer AR-5120 (Ohaus, США);– термостат BD 115 (Binder, Германия);– рН-метр S220 SevenCompact (Mettler Toledo AG, Китай).Изучениемолекулярно-массовогораспределениямолекулиммуноглобулина проводили с использованием:– хроматограф: ВЭЖХ-система Alliance на основе сепарационного модуля2695,WatersCor.,США.Дляразделенияобразцовнакомпоненты,соответствующие их молекулярным размерам использовали эксклюзионнуюхроматографическую колонку TSKgel G3000SWXL, 7,8 мм×300 мм, размер частиц5 мкм (№ 0008541, Tosoh Bioscience, Германия) + предколонка: TSKgelG3000SWXL, 6,0 мм×40 мм, размер частиц 7 мкм (№ 0008543, Tosoh Bioscience,Германия).
УФ-детектирование осуществляется при λ=280 нм.452.2. МетодыМолекулярно-массовое распределение молекул иммуноглобулина изучали спомощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии [51].Содержание белка определяли колориметрическим методом с биуретовымреактивом [50].Антикомплементарную активность ЛП ИГВВ определяли в реакциисвязывания комплемента.Методика определения антикомплементарной активностиДля определения антикомплементарной активности иммуноглобулиначеловекадлявнутривенноговведенияберутфиксированноеколичествоиспытуемого образца (10 мг иммуноглобулина в объеме 0,2 мл 5 % раствора) иинкубируют с определенным количеством комплемента морских свинок(20 СН50);затемдобавляютсенсибилизированныеэритроцитыбаранаиопределяют количество несвязавшегося комплемента.Подготовка 5 % суспензии эритроцитов барана.
Эритроциты баранаотделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированнойкрови барана в течение 5 мин при 3000 об/мин (1000 g). Осадок эритроцитовпромывают не менее трех раз 10-кратным (к объему эритроцитов) объемомбуферного раствора до получения бесцветной промывной жидкости. Отбираютопределенный объем отмытых эритроцитов и смешивают с рассчитаннымколичеством буферного раствора для получения 5 % суспензии (об/об).Плотность клеточной суспензии определяют следующим образом: 0,2 млполученной суспензии эритроцитов прибавляют к 2,8 мл воды очищенной,перемешивают, центрифугируют полученный раствор в течение 5 мин при3000 об/мин, измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре придлине волны 541 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм (раствор сравнения – водаочищенная).
Суспензия пригодна для испытания, если измеренная оптическаяплотность супернатанта составляет 0,62±0,01.46Корректируют плотность суспензии до указанного показателя добавлениемнеобходимого количества отмытых эритроцитов, если оптическая плотность ниже0,61, либо рассчитанным по формуле (1) количеством буферного раствора, еслиоптическая плотность выше 0,63:н,VБР(1)где: VБР – добавочный объем буферного раствора, мл;VН – начальный объем суспензии, мл;А – значение оптической плотности исходной суспензии;0,62 – целевое значение оптической плотности.Титрование гемолитической сывороткиГотовят серию разведений гемолитической сыворотки, в соответствии сТаблицей 1 (значения разведений гемолитической сыворотки могут бытьизменены).Таблица 1 – Порядок приготовления разведений гемолитической сывороткиРазведениегемолитическойсыворотки1:50Используемые растворыГемолитическая сывороткаРазведениеОбъем, млБез разведения0,1Объем буферногораствора, мл4,91:1001,01:501,01:2504,01:501,01:5002,01:2502,01:10002,01:5002,01:20001,51:10001,51:30002,01:10001,01:40001,01:20001,0Далее из каждой пробирки с полученными разведениями гемолитическойсыворотки переносят по 1,0 мл в новые пробирки, добавляют по 1,0 мл 5 %47суспензии эритроцитов и осторожно перемешивают.
Пробы инкубируют притемпературе 37,0±0,5 °С в течение 30 мин.По окончании инкубации по 0,2 мл каждой из этих инкубированных пробпереносят в новые пробирки и прибавляют по 1,1 мл буферного раствора и по0,2 мл предварительно приготовленного раствора комплемента (например,разведение 1:150). Испытание выполняют в двух повторностях.Для приготовления контрольных проб без гемолиза в три пробирки вносятпо 1,4 мл буферного раствора и по 0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов.Для приготовления контрольных проб с полным гемолизом в три пробиркивносят по 1,4 мл воды очищенной и по 0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов.Пробы инкубируют в термостате при температуре 37,0±0,5 °С в течение60 мин, затем охлаждают 10 мин при температуре 5±3 °С и центрифугируют при3000 об/мин в течение 5 мин.Определяютоптическуюплотностьнадосадочнойжидкостинаспектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 541 нм.Рассчитывают степень гемолиза в процентах (Y%) в каждой пробирке поформуле (2):Y%пк×100%,(2)где: Ап – среднее значение оптической плотности разведений гемолитическойсыворотки;Ао – среднее значение оптической плотности контрольных проб безгемолиза;Ак – среднее значение оптической плотности контрольных проб с полнымгемолизом.Строят график, откладывая по оси ординат степень гемолиза в процентах, апоосиабсцисс–обратныегемолитической сыворотки.значениясоответствующегоразведения48Результаты титрования гемолитической сыворотки считают достоверными,если максимальная степень гемолиза находится в пределах 50–70 %.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
