Диссертация (1141376), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Валидацию проводили с использованием СОиммуноглобулина человека BRP серия 1.71ПравильностьПри оценке правильности критерием приемлемости служили значения АКАотрицательного и положительного контролей СО иммуноглобулина человекаBRP, соответствующие аттестованным: 10-40% для отрицательного контроля; 60100% для положительного контроля. Значения АКА СО иммуноглобулиначеловекаBRP,полученныевнастоящемисследовании,находилисьваттестованных интервалах и составляли от 17,1 до 23,5 % (среднее значениесоставило 20,0 %) для отрицательного контроля и от 79,1 до 88,5 % (среднеезначение составило 85,4 %) для положительного контроля.
Таким образом,валидируемая методика характеризуется приемлемой правильностью.ПрецизионностьДляхарактеристикипрецизионностиоценивалиповторяемостьивнутрилабораторную прецизионность (по фактору время и операторы) [57].Проводили многократные измерения аттестованной характеристики (АКА)отрицательного и положительного контроля СО иммуноглобулина человека BRP:7 групп (L=7) измерений в условиях повторяемости (n=2).Рассчитывали среднее арифметическое значение (х) и выборочнуюдисперсию (S2l) результатов единичных измерений по формулам 8 и 10соответственно.Гипотезу о равенстве генеральных дисперсий проверяли, используякритерий Кохрена (G) [56]. Расчетное значение критерия Кохрена (Gрасч.)вычисляли по формуле 11.
Полученную величину сравнивали с критическимзначением для критерия Кохрена – Gтабл. (Gтабл.=0,727), которое выбирали взависимости от трех основных параметров:– заданной доверительной вероятности P≥0,95;– числа степеней свободы наибольшей дисперсии – количество дисперсий, по которым рассчитывают сумму, стоящую взнаменателе f =L=7 (в таблице И РМГ 61-2010) [56].Соотношение(Gрасч.<Gтабл.)дляотрицательногоиположительногоконтролей выполнено, следовательно, дисперсии можно считать однородными и72по ним рассчитывалистандартное отклонение.Стандартное отклонениепоказателя повторяемости (σr) считали равным выборочному стандартномуотклонению повторяемости (Sr).Выборочное стандартное отклонение повторяемости рассчитывали поформуле12,получилидляотрицательногоконтроляповторяемости(CV),Sr=0,212;дляположительного контроля Sr=0,158.Коэффициентвариациихарактеризующийповторяемость результатов измерений АКА отрицательного и положительногоконтролей СО иммуноглобулина человека BRP рассчитывали по формуле 13 иполучили для отрицательного контроля CV=1,07 %; для положительногоконтроля CV=0,18 %.
Аналогичным образом провели статистическую обработкуполученных результатов для аналитика II.Таким образом, валидационное исследование повторяемости позволилосделать вывод о том, что для отрицательного контроля СО иммуноглобулиначеловека BRP коэффициент вариации составил 1,07 % и 1,03 % для аналитика I иII соответственно, для положительного контроля – 0,18 % и 0,31 % для аналитикаI и II соответственно (Таблица 7), что удовлетворяет критерию приемлемости – недолжен превышать 2 % [54].Оператор IIОператор IОператор IIОператор IОператорТаблица 7 – Оценка повторяемости результатов измерений стандартного образца Европейской фармакопеиНомериспытания(Li, i=1…7)Результат измерения,полученный в условияхповторяемостиXl1Xl21234567123456717,517,118,822,720,823,119,119,519,417,123,422,518,420,317,617,518,322,720,623,419,419,218,917,323,522,918,620,21234567123456786,686,782,987,387,888,385,886,985,879,182,881,985,387,186,686,782,987,487,888,586,187,186,279,282,881,785,587,4Выборочная дисперсияСумма всех дисперсий,результатов измерений(в условиях повторяемости)S2lОтрицательный контроль0,0050,0780,1220,0000,3140,0190,0450,0450,0450,1250,0200,0050,3000,0800,0200,005Положительный контроль0,0000,0000,0000,0130,1750,0000,0500,1120,0500,2000,0130,0000,4760,0500,0500,113Расчетноезначение критерияКохрена, Gрасч.Стандартноеотклонениеповторяемости, σr, %Коэффициентвариации,(CV), %0,3880,2121,070,4160,2071,030,6400,1580,180,4200,2610,31Внутрилабораторную прецизионность оценивали по результатам 7определений, стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности пофактору время (σR) принимали равным выборочному стандартному отклонению:(SR), которое рассчитывали по формуле 14 [56].
Получили следующие значенияоператор I: для отрицательного контроля равные 2,39 %; для положительногоконтроля – 1,80 %; оператор II: для отрицательного контроля – 2,26 %; дляположительного контроля – 3,02 %. Аналогичным образом рассчитывалистандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности по фактору время иоператоры, получили значения для отрицательного контроля равные 2,23 %; дляположительного контроля – 2,68 %.Коэффициент вариации внутрилабораторной прецизионности по факторувремя (CV) рассчитывали по формуле 13.Проведенныеисследованиявнутрилабораторнойпрецизионности,позволили сделать вывод о том, что коэффициент вариации внутрилабораторнойпрецизионности(пофакторувремя)дляотрицательногоконтроляСОиммуноглобулина человека BRP составил 11,97 % (оператор I) и 11,23 %(оператор II), для положительного контроля – 2,08 % (оператор I) и 3,59 %(оператор II).
Аналогичным образом рассчитывали коэффициент вариациивнутрилабораторной прецизионности (по фактору время и операторы), которыйсоставил 11,16 % для отрицательного контроля и 3,14 % для положительногоконтроля СО иммуноглобулина человека BRP (Таблица 8), что удовлетворяеткритерию приемлемости – не более 15 % (для биологических методов контроля)[54].В случае оценки приемлемости внутрилабораторной прецизионностинормативные и методические документы в сфере GMP [54, 135] рекомендуютрассчитывать статистические критерии Фишера (F) и Стьюдента (t) и сравниватьфактические значения tфакт.
и Fфакт. с табличными – максимальными значениямикритериев под влиянием случайных факторов при текущих степенях свободы ипри заданном уровне значимости (tтабл. и Fтабл.).75Таблица 8 – Результатыоценкивнутрилабораторнойпрецизионностивалидируемой методики№ исследования1234567Оператор IОтрицательный Положительныйконтрольконтроль17,686,617,386,718,682,922,787,420,787,823,388,419,386,019,920,1Среднеезначение, %Стандартное2,39отклонение, %Коэффициент11,97вариации, %Доверительный±2,21интервал (Р≥95%), %Объединенное среднее значение, %Объединенное стандартное отклонение, %Объединенный коэффициент вариации, %Объединенный доверительный интервал, %F-критерий Фишера (Fтабл.=4,28), Р≥0,95t-критерий Стьюдента (tтабл.=2,18), Р≥0,95Оператор IIОтрицательный Положительныйконтрольконтроль19,487,019,286,017,279,223,582,822,781,818,585,420,387,386,584,22,261,803,0211,232,083,59±2,09±1,67±2,7920,02,2311,16±1,29Fфакт.=1,12tфакт.=0,1685,42,683,14±1,65Fфакт.=2,81tфакт.=1,73Таким образом, табличные значения F- и t-критериев превосходятфактические значения, что свидетельствует о статистической незначимостиразличиймеждусреднимизначениямиистандартнымиотклонениямирезультатов измерений двух операторов с достоверностью 95%.Специфичность определения АКА можно считать доказанной, т.к.
вкачестве индикаторной системы результата реакции используется комплементиндуцированный гемолиз оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана.Предел количественного определенияТак как единица гемолитической активности комплемента (1 СН50)определяется как количество комплемента, которое в определенных условиях76опыта вызывает гемолиз 50 % оптимально сенсибилизированных эритроцитов(2,5×108 клеток) из общего количества (5×108 клеток), объем соответствующимобразом разбавленного комплемента, приводящий к 50 % степени гемолиза,определяется титрованием комплемента. Поэтому предел количественногоопределения равен 1 СН50/мл, что соответствует значению АКА равному 1 % или0,02 СН50/мг иммуноглобулина.ЛинейностьДля построения графиков зависимости степени гемолиза от объемаразведения комплемента и установления их линейности необходимо быловыполнить измерения оптической плотности в пробах контроля комплемента,отрицательном и положительном контроле СО иммуноглобулина человека BRP, атакже рассчитать степень гемолиза и соотношение Y/(1-Y), результатыпредставлены в Таблице 9.Критерий приемлемости при оценке линейности: график зависимостистепени гемолиза от объема разведения комплемента при визуальном осмотредолжен иметь линейный характер на участке от 0,15 до 0,85 степени гемолиза[49].Таблица 9 – Определение антикомплементарной активности отрицательного и положительного контролей стандартногообразца иммуноглобулина человека BRPНомер пробиркиОбъем буферного раствора, млОбъем воды, млОбъем разведениякомплемента/контролей, млОбъем гемолитическойсистемы, млСредняя оптическая плотность(контроль комплемента)Средняя оптическая плотность(отрицательный контроль)Средняя оптическая плотность(положительный контроль)Степень гемолиза Y(контроль комплемента)Степень гемолиза Y(отрицательный контроль)Степень гемолиза Y(положительный контроль)Контроль комплемента(Y/(1-Y))Отрицательный контроль(Y/(1-Y))Положительный контроль(Y/(1-Y))11,2–21,1–31,0–40,9–50,8–60,7–70,6–80,5–90,4–100,3–110,2–120,1–13 к1,3–14 к1,30,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2––0,20,20,20,20,20,20,20,20,20,20,20,20,20,20,002 0,037 0,088 0,211 0,376 0,4860,5420,5590,5680,5780,5890,5930,001 0,019 0,052 0,086 0,199 0,3190,4170,4880,5460,5650,5730,5850,003 0,032 0,144 0,298 0,4340,530,5530,5790,5870,5890,5910,5970,003 0,062 0,147 0,353 0,629 0,8130,9060,9350,9500,9670,9850,9920,002 0,032 0,087 0,144 0,333 0,5330,6970,8160,9130,9450,9580,9780,005 0,054 0,241 0,498 0,726 0,8860,9250,9680,9820,9850,9880,9980,003 0,066 0,173 0,545 1,694 4,3399,67914,333 18,933 28,900 65,444 118,6000,002 0,033 0,095 0,168 0,499 1,1432,3044,43610,500 17,121 22,92045,0000,005 0,057 0,317 0,993 2,646 7,794 12,289 30,474 53,364 65,444 84,429 597,0000,000 0,5980,000 1,000––Графики зависимости степени гемолиза от объема разведения комплемента(в мл) в контроле комплемента, отрицательном и положительном контролях СОиммуноглобулина человека BRP, доказывающие линейный характер на участке от0,15 до 0,85 степени гемолиза, представлены на Рисунке 5.(А)(Б)(В)Рисунок 5 – Графики зависимости степени гемолиза от объема разведениякомплемента в (А) – контроле комплемента, (Б) – отрицательном контроле,(В) – положительном контроле79С помощью программного обеспечения строили в логарифмическоммасштабе график со значениями Y/(1-Y) по оси абсцисс и объемом разведения(в мл) по оси ординат (Рисунок 6).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
