Диссертация (1141376), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Общий объем раствора доводят водой очищенной до метки иперемешивают. Доводят рН раствора до 7,2-7,3 с помощью 0,1М раствора натриягидроксида. Раствор используют свежеприготовленным.1.2. Приготовление желатин-барбиталового буферного раствора.1.2.1. Приготовление исходного раствора кальция и магния хлорида. Вмерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в небольшом количестве водыочищенной 4,412 г кальция хлорида дигидрата и 20,332 г магния хлорида 6-ти55водного, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.Раствор хранят при температуре 5±3 ºС в течение 1 мес.1.2.2. Приготовлениеисходногобарбиталовогобуферногораствора(рН 7,3). В мерной колбе вместимостью 2000 мл растворяют, постоянноперемешивая, 83,000 г натрия хлорида и 10,192 г барбитала натрия в 1700 мл водыочищенной.
Показатель рН доводят до 7,3 1М с помощью растворахлористоводородной кислоты. Добавляют 5 мл исходного раствора кальция имагния хлорида, доводят объем раствора водой очищенной до метки иперемешивают. Раствор хранят при температуре 5±3 ºС в течение 1 мес.1.2.3. Приготовление раствора желатина. В мерную колбу вместимостью1000 мл помещают 1,25 г желатина, прибавляют 500 мл воды очищенной итщательно перемешивают. Полученную смесь нагревают при температуре45±3 °С до полного растворения желатина. Полученный раствор охлаждают докомнатной температуры, доводят объем раствора водой очищенной до метки иперемешивают. Используют только свежеприготовленный раствор.1.2.4.
Приготовлениежелатин-барбиталовогобуферногораствора.Прибавляют 4 части раствора желатина к 1 части исходного барбиталовогобуферного раствора, тщательно перемешивают и доводят рН до 7,2-7,3 спомощью 1М раствора натрия гидроксида или 1М раствором хлористоводороднойкислоты. Раствор используют свежеприготовленным.2. Подготовка контрольных образцов. Подготовку отрицательного иположительного контролей осуществляют в соответствии с прилагаемойинструкцией по применению к СО иммуноглобулина человека.3.
Приготовление стабилизированной крови барана. Берут один объемкрови барана и один объем цитратного раствора, перемешивают. Хранят притемпературе 5±3 °С. Стабилизированную кровь барана можно использовать втечение 28 суток, но не ранее чем через 7 суток после взятия.4. Приготовление цитратного раствора. Растворяют в 750 мл водыочищенной 20,5 г глюкозы, 8,0 г натрия лимоннокислого трехзамещенного и 4,2 гнатрия хлорида, устанавливают рН раствора 6,1 раствором лимонной кислоты56(100 г/л), доводят объем раствора до 1000 мл водой очищенной. Стерилизуюттекучим паром в течение 30 мин при температуре 100 °С. Хранят при температуре5±3 °С в течение 1 мес.5. Приготовлениесенсибилизированныхгемолитическойэритроцитовбарана).системыГемолитическая(суспензиисыворотка–иммунная сыворотка против эритроцитов барана, которую получают путемиммунизации кроликов. (Такие гемолитические сыворотки предлагаются рядомкоммерческих источников).Для получения гемолитической системы гемолитическую сыворотку,разведенную до 2 МГЕ/мл, добавляют к 5 % суспензии эритроцитов барана всоотношении 1:1.
Инкубируют в термостате при температуре 37,0±0,5 °С втечение 15 мин, после чего хранят при температуре 5±3 °С и используют втечение 6 ч.6. Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее10 морских свинок. Сыворотку отделяют от сгустка крови центрифугированиемпри температуре 4 °С. Хранят в небольших количествах при температуре нижеминус 70 °С.7. Приготовление раствора комплемента, содержащего 100 СН50/мл. Взависимости от исходной активности комплемента 1 мл раствора комплементаразбавляют буферным раствором до содержания 100 СН50/мл.В настоящем исследовании также использовались общенаучные методы:обобщения,экспериментальный(сравнения),формальнойлогики,ретроспективный анализ.Статистические методыВ настоящем исследовании экспериментальные величины представлены в виде:среднего арифметического значения (х) и стандартного отклонения (Sх).Вычисляли среднее арифметическое значение (х) по результатам серии измеренийпо формуле (8):(8)57Вычисляли стандартное отклонение (Sх) результатов измерений с использованиемформулы (9):х(9)Вычисляли выборочную дисперсию (S2l) результатов единичных измерений сиспользованием формулы (10):(10)Расчетное значение критерия Кохрена (Gрасч.) вычисляли как отношениенаибольшей дисперсии для данной выборки к сумме всех дисперсий по формуле(11):Gрасч.
=(11)Выборочное стандартное отклонение повторяемости (Sr) рассчитывали каккорень квадратный из общей средней дисперсии повторяемости по формуле (12):Sr=(12)Коэффициент вариации прецизионности/повторяемости (CV) рассчитывалипо формуле (13):CV =*100%(13)где σR/r – стандартное отклонение прецизионности/повторяемости.Выборочное стандартное отклонение внутрилабораторной прецизионности(SR) рассчитывали по формуле (14):SR =,(14)58где: L – число результатов измерений в условиях промежуточнойпрецизионности;n – число результатов измерений в условиях повторяемости;N=nL – число всех результатов измерений.Диапазон аттестуемых значений (ΔX) со степенью достоверности 95 % вычислялипо формуле (15):ΔX= ± 2Sх(15)Статистическую оценку достоверности различий результатов исследованийпроводили с применением параметрических критериев однофакторного дисперсногоанализа [12].Для оценки различий средних значений АКА ЛП ИГВВ с и безкорректировки рН использовали t-критерий Стьюдента для числа степенейсвободы f=n-1 (для выборок одинакового объема) и уровня значимости α=0,05(доверительной вероятностью Р≥0,95).
Экспериментальное значение t-критерияСтьюдента (tэксп.) рассчитывали по формуле (16):хкспх,(16)где: х1, х2 – среднее значение измеряемой величины сравниваемых группданных (выборок);SХ1, SХ2 – стандартные отклонения выборок;n1, n2 – объем первой и второй выборки [12].Призначенииэкспериментальногоt-критерияСтьюдента,превышающего табличное, считали, что различия статистически незначимы.не59СпомощьюF-критерияФишераоценивалистатистическуюэквивалентность стандартных отклонений результатов исследований, полученныхразными операторами. Для этого вычисляли критерий Фишера по формуле (17):большее(17)меньшееПолуширину доверительного интервала для среднего при заданном уровнедостоверности (Р≥0,95) рассчитывали по формуле (18):,где: f – число степеней свободы;n – объем выборки;t – коэффициент Стьюдента.(18)60ГЛАВА 3.
РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ДЛЯОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ3.1. Стандартизация методики определения антикомплементарнойактивностиПри проведении исследований с использованием СО иммуноглобулиначеловека BRP по методике, изложенной в Методических указаниях [52],полученные нами результаты показали непригодность использования даннойметодики для испытаний указанного СО, т.к. были получены значения АКАотрицательного и положительного контролей несоответствующие аттестованным,указанным в листе-вкладыше на СО.В целях оптимизации методики определения АКА ЛП ИГВВ нами былавзята за основу методика ЕФ и адаптирована к реагентам и оборудованию,которые могут быть приобретены и использованы на территории РФ.3.1.1.
Изучение влияния компонентов гемолитической системы иисходного значения рН лекарственных препаратов иммуноглобулина нарезультат определения антикомплементарной активностиМетодикаопределенияАКАпредусматриваетприготовлениегемолитической системы, состоящей из гемолитической сыворотки и 5 %суспензии эритроцитов барана в соотношении 1:1.
Исследования несколькихсерий гемолитической сыворотки различного производства позволили определитьих одинаковую активность. Одна минимальная гемолитическая единица в 1 мл(МГЕ/мл) содержалась в разведении 1:500, соответственно при определении АКАнеобходимо(Рисунок 3).использовать2 МГЕ/мл,содержащиесявразведении1:25061(1)(2)(3)Рисунок 3 – Результаты определения 1 МГЕ/мл гемолитических сыворотокпроизводства: 1 – Siemens, Германия, 2 – ЗАО «ЭКОлаб», Россия,3 – ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, Россия62Для получения 5 % суспензии эритроцитов барана возможно использованиекрови бараньей дефибринированной или дефибринированной с цитратом натрия.Из-за нестабильности крови бараньей дефибринированной ее применениеограничено 14 сутками, после чего начинается спонтанный гемолиз, поэтому внастоящем исследовании предпочтение отдано использованию крови бараньейдефибринированной с цитратом натрия.В методике определения АКА рекомендуется перед началом исследованияпри необходимости произвести для исследуемого образца иммуноглобулинакорректировку значений рН до 7,0 с помощью 0,1М раствора натрия гидроксида[88].
В нормативной документации могут быть предусмотрены иные указания,основанные на результатах, полученных в ходе валидационных исследований. Внастоящее время в РФ зарегистрировано 18 наименований ЛП ИГВВотечественного и зарубежного производства [18], из них 50 % отечественных и75 % зарубежных ЛП имеют слабокислую реакцию среды (рН от 4,0 до 5,3 и от4,0 до 6,0 соответственно).В настоящем исследовании изучили влияние исходного значения рН ЛПИГВВнарезультатиммуноглобулинаопределениячеловекаАКА.нормальногоИспользовалиотечественногообразцыиЛПзарубежногопроизводства с содержанием белка от 50 до 100 мг/мл; значениями рН от 4,0 до6,0.Для сравнения результатов применяли дифференциальный t-тест [12],рассчитывали значения по формуле 16 (Таблице 4).
Для всех исследованных ЛПИГВВ различие статистически значимо, т.к. tэксп.>t: Имбиоглобулин (7,1>2,37);Габриглобин®-IgG (10,3>2,31); Октагам (7,2>2,23); Октагам 10% (4,6>2,31);Гамунекс (26,1>2,57); Привиджен (7,8>2,31). Для всех исследованных ЛП, кромеЛП Гамунекс, получены более высокие значения АКА без корректировкиисходного значения рН ЛП иммуноглобулина, чем после корректировки рН до7,0-7,3, в то же время стоит отметить, что все полученные значения АКАукладывались в нормативные требования – не более 1 СН50/мг белка.63Таблица 4 – Изучение влияния исходного значения рН лекарственных препаратовиммуноглобулиновчеловеканарезультатопределенияантикомплементарной активностиНаименованиеРазность антикомплементарнойВеличинаКритическаялекарственного препаратаактивности с и без корректировкиtэксп.величина t(количество исследований)исходного значения рН,(P≥0,95)СН50/мг белка, х ±SxИмбиоглобулин (8)0,19±0,067,12,37Габриглобин®-IgG (9)0,37±0,1010,32,31Октагам (11)0,30±0,117,22,23Октагам 10 % (9)0,32±0,184,62,31Гамунекс (6)0,60±0,0626,12,57Привиджен (9)0,30±0,097,82,31Сравнивая полученные значения tэксп.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
