Диссертация (1141376), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Скорость потока, давление, процедура регенерациии т.д. влияют на молекулы IgG; стадия приготовления готовой формы: регулирование рН, осмоляльностьи концентрация белка являются параметрами, воздействующими на молекулы IgGв контейнере готовой лекарственной формы.Агрегированные молекулы IgG с АКА, предположительно, являютсяединственным возможным объяснением нежелательных реакций, которые могутпроизойти у пациентов, получающих терапию ЛП ИГВВ.
Вследствие этого АКАЛП ИГВВ важно определять. Физические характеристики и концентрацияагрегатов в ЛП ИГВВ оказывают влияние на АКА [80].В настоящее время известно несколько способов снижения АКА ЛПиммуноглобулинов человека, основанных на изменении, удалении и разрушениикомпонентов, обладающих антикомплементарными свойствами [1, 7, 77, 78, 83,128-130].УстранениеАКАпрепаратовиммуноглобулиноввозможноприменением соответствующих современных технологий в промышленномпроизводствеЛП.Снижениереактогенностииммуноглобулиновпривнутривенном введении, главным образом, достигается разрушением агрегатов[24].Способыобработкииммуноглобулиновдляустраненияантикомплементарных свойств, имеющие практическое значение при полученииЛП для внутривенного введения, следующие:– ферментативное расщепление (пепсин, плазмин);– обработка кислотой или кислотой в присутствии пепсина;– обработка β-пропиолактоном, дитиотрентолом;– осаждение риванолом;29– обработка сорбентами (уголь, фосфат кальция);– использование полиэтиленгликоля и хроматографической очистки.С целью снижения АКА при производстве иммуноглобулинов различногопоколенияприменяютсоответствующиеметоды,направленныенапредотвращение агрегации молекул IgG:– ЛПпервогопоколенияполучаютсиспользованиемметодомферментативного расщепления (пепсин, плазмин) и кислотного гидролиза притемпературе 37 °С в течение 1 суток в слабокислой среде с рН 4,0;– ЛП второго поколения получают путем химической модификации спомощью обработки β-пропиолактоном, дитиотрентолом, сорбентами (уголь,фосфат кальция) [97, 133, 137];– ЛП третьего и четвертого поколения практически свободны от агрегатов,обладающих антикомплементарными свойствами, благодаря обработке малымколичествомпепсинапринизкихзначенияхрН(4,0),использованиемполиэтиленгликоля и хроматографической очистки [90, 130].Однако повышение толерантности в отношении внутривенного введениясопровождается значительным снижением терапевтической эффективности ЛП.Так, при применении небольших количеств фермента происходит восстановлениев процессе хранения антикомплементарных свойств иммуноглобулинов, а приусилении ферментативного гидролиза – к значительному расщеплению молекулиммуноглобулинов и как следствие происходит быстрое выведение IgG изорганизма.Следовательно,необходимбалансмеждуспецифическойбезопасностью, снижая антикомплементарные свойства путем устранения илипредотвращения агрегации молекул IgG, и сохранением терапевтическойэффективности инфузий иммуноглобулинов.Внедрение в технологический процесс производства препаратов ИГВВдополнительных стадий инактивации/удаления вирусов должно сопровождатьсяизучением их влияния на уровень АКА, в частности сольвент-детергентнаяобработка может способствовать увеличению антикомплементарных свойствиммуноглобулина [25].30Существует множество способов и методов оценки состояния системыкомплемента (иммунохимический и функциональный анализы).
Их используютпреимущественно в диагностических целях для оценки статуса иммуннойсистемы организма, а также для нужд фармацевтического анализа при проведенииконтроля качества ЛП ИГВВ, заключающегося в определении их АКА. Однако,не все методики пригодные для диагностических целей применимы дляопределения АКА ЛП иммуноглобулинов человека.В фармацевтическом анализе при проведении контроля качества ЛП ИГВВнаибольшее распространение получил функциональный анализ (гемолитическиеметоды СН50, СН100). В данном виде анализа тест-система включает в себясенсибилизированные эритроциты барана, вызывающие активацию комплементапо классическому пути, сборку мембраноатакующего комплекса и лизис клеток.Активность комплемента определяется спектрофотометрическим методом повышедшему из эритроцитов в результате гемолиза гемоглобину [19, 27, 127].При разработке такой тест-системы in vitro проводились сравнительныеисследованиявозможностииспользованияэритроцитовразличныхвидовживотных (птиц, млекопитающих) для того, чтобы выяснить, какие из них легчевсего гемолизируются антителами и комплементом [19, 125].
Полученныерезультаты свидетельствовали о том, что бараньи эритроциты оказались наиболееподходящими, т.к. после сенсибилизации антителами они обладали оченьвысокой чувствительностью к гемолитическому действию комплемента. Крометого, было обнаружено, что на поверхности бараньих эритроцитов имеетсяантиген липополисахаридной природы (антиген Форссмана), к которому легкоможно было получить кроличьи антитела с высоким титром [76].Также рядом исследователей проведены работы по изучению возможностииспользоватьвкачествеисточникакомплемента–сывороткулюбыхмлекопитающих. Однако, полученные результаты свидетельствовали о том, чтолитическая активность у разных видов млекопитающих значительно различается,наибольшей литической активностью обладает свежая сыворотка крови морскихсвинок [19, 101, 112, 114, 131]. Таким образом, для изучения активности31комплемента использовалась тест-система, в которой эритроциты баранаобрабатывали кроличьими антителами (гемолитическая сыворотка) и исследовалиих лизис в свежей сыворотке крови морских свинок [119].Метод определения АКА основан на способности иммуноглобулиновчеловеканеспецифическисвязыватькомплемент,препятствуялизисусенсибилизированных эритроцитов барана [52, 103].
Все известные методыопределения АКА являются модификацией метода «реакции связываниякомплемента» [19].Реакциясвязываниякомплемента(РСК)основананаспособностикомплемента присоединяться к комплексу антиген-антитело. Соединившись содним таким комплексом, комплемент не может перейти на другой комплекс,вводимый в реакционную смесь после взаимодействия первого комплекса идобавленного в известном количестве комплемента. В качестве второгокомплекса обычно используют гемолитическую систему (эритроциты барана,сенсибилизированныегемолитическойсывороткой),выполняющуюиндикаторную функцию.
Если первый комплекс является комплексом антигенантитело, то свободного комплемента в реакционной смеси не будет,следовательно, гемолизаэритроцитовнепроизойдет,инаоборот, есликомплемент не был связан, по причине отсутствия первого комплекса, то онпрореагирует со вторым комплексом и вызовет гемолиз сенсибилизированныхэритроцитов барана.Ранее большинство методик РСК было основано на применении двух СН100[111], однако, определение 100 % гемолиза не позволяет точно определитьконечную точку при гемолитическом титровании комплемента.
Поэтому дозукомплемента стали выражать в двух «50 % гемолитических единицах» (2 СН50).Указанная доза комплемента вызывает около 90 % гемолиза и по снижениюстепени гемолиза можно определить связывание комплемента любой степени.Одна СН50 – это количество комплемента, которое в определенных условияхопыта вызывает гемолиз 50 % оптимально сенсибилизированных эритроцитов изобщего количества (5×108 клеток). Для связывания комплемента необходимо32наличие ионовCa2+ и Mg2+, содержащихся в буферных растворах всоответствующей концентрации [93, 107, 108]. Кроме того, СН50 – единицаусловная, и ее величина зависит от значения рН и ионной силы системы,концентрации эритроцитов и количества антител, использованных для ихсенсибилизации, времени реакции и температуры [82].Как и многие гемолитические методы, первоначально для интерпретациирезультатов исследования применяли грубую систему учета по количествукрестов (+, ++, +++ и ++++) – качественный анализ связывания комплемента.
Дляповышения чувствительности и точности количественного учета потребовалосьиспользование инструментального метода анализа, при котором количествосвязанных СН50 измеряли точно с помощью спектрофотометрии [19, 40].Проведенныйанализнаучнойлитературыпозволилвыявить,чтокритическими параметрами, влияющими на конечный результат определенияАКА ЛП ИГВВ, являются: активность применяемой гемолитической сыворотки;эритроциты барана; комплемент морских свинок; состав буферного раствора, еготемпература и рН [82]. Влияние состава, рН, температуры используемогобуферного раствора изучено в исследованиях Mayer (1961) [108], влияниеактивности и различных разведений гемолитической сыворотки оценивалось висследованияхBorg(2009)[80],изучениювлиянияразличныхпартийэритроцитов барана и их подготовке уделено внимание в исследованияхBuchacher и соавт. (2010) [82], поэтому дополнительных работ в рамках данногоисследования по указанным параметрам не проводилось.В настоящее время в международной практике нормативные требования дляАКА ЛП ИГВВ установлены на уровне не более 50 %, что соответствует не более1 СН50/мг белка иммуноглобулина [88, 89].
Важно также помнить не только оприемлемом уровне АКА, но и о постоянстве данного параметра у различныхсерий ЛП ИГВВ одного и того же производителя. Вариабельность АКА от серии ксерии указывает на нестабильность технологии получения ЛП ИГВВ, и требуетособо пристального внимания контролирующих органов [25].33Результаты, полученные в исследованиях Buchaher и соавт.
(2010) иRamasamy и соавт. (1997), указывают на то, что физические характеристикиагрегатов оказывают значительное влияние на результат определения АКА.Агрегаты, сформированные нагреванием ЛП ИГВВ в кислой среде (рН 4,2),связывают комплемент морских свинок слабо, в то же время агрегаты,образованные нагреванием ЛП ИГВВ в нейтральной среде (рН 7,0.), показаливысокие значения АКА [82, 95, 116].Также Buchaher и соавт. (2010) было показано, что измерение с помощьюдетектора рассеивания света в образцах иммуноглобулина после нагреванияпозволяет выявить увеличение числа крупных агрегатов IgG, в то время как нахроматограммахэксклюзионнойхроматографииненаблюдаетсяэтоговыраженного сдвига в сторону крупных агрегатов IgG.
Известно, чтоэксклюзионная хроматография не является оптимальным методом определениякрупных агрегатов, т. к. они могут быть удалены при фильтрации исследуемогообразца или их истинное содержание может быть сдвинуто в сторону уменьшенияпри разбавлении пробы, необходимой для эксклюзионной хроматографии. Крометого, чувствительность крупных агрегатов очень низкая при использовании УФдетектора по сравнению с детектором рассеивания света.
Тем не менее, до техпор, пока измерение с помощью детектора рассеивания света не может бытьвыполнено количественно, оба метода должны быть использованы дляхарактеристики молекулярно-массового распределения молекул ЛП ИГВВ [71,73, 82].Способность каждого ЛП ИГВВ к образованию агрегатов, обусловлена содной стороны влиянием технологического процесса производства и, с другойстороны, составом ЛП, сроком и условиями хранения.
При разработке технологиина различных стадиях технологического процесса должны быть отобраныобразцы и проанализированы с помощью различных аналитических методов –эксклюзионнойхроматографиииболеечувствительныхметодовсиспользованием детектора рассеивания света, чтобы обнаружить стадии,способствующие денатурации и агрегации молекул IgG [73-75]. Образование34агрегатов может быть сведено к минимуму за счет оптимизации параметровкаждой стадии фракционирования на протяжении всего технологическогопроцесса.
Таким образом, следует избегать образования агрегатов, а внедрениестадий удаления агрегатов является возможной стратегией для получения ЛПИГВВ свободных от агрегатов. Другая возможность состоит в удалении АКА посредствам обработки при низком значении рН [82].Технологический процесс фармацевтического производства ЛП ИГВВдолженобеспечиватьполучениенативныхнеповрежденныхмолекулиммуноглобулина с целостной структурой, сохранившей свою функциональнуюактивность, т.е. способной специфически взаимодействовать с комплементом всоставе иммунного комплекса, таким образом, проявлять терапевтическуюэффективность, и одновременно, исключать возможность образования молекул,обладающих способностью к спонтанной неспецифической активации системыкомплемента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
