Диссертация (1141376), страница 8

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

Еслимаксимальная степень гемолиза не находится в этих пределах, титрованиеповторяютсиспользованием менееилиболееразбавленногорастворакомплемента, соответственно.Определяют минимальное разведение, при котором дальнейшее повышениеколичества гемолитической сыворотки не вызывает существенного повышениястепени гемолиза. Это разведение определяется как одна минимальнаягемолитическая единица (1 МГЕ) в 1 мл.Вдальнейшемэритроцитовбаранадляприготовленияиспользуютсуспензииразведениесенсибилизированныхгемолитическойсыворотки,содержащее 2 МГЕ/мл (например, если за 1 МГЕ/мл принимают разведение 1:500,то 2 МГЕ/мл – 1:250).При проведении последующих испытаний с использованием образцовгемолитической сыворотки той же серииможно использовать данные,полученные ранее.Рекомендуется определять гемолитическую активность используемой сериигемолитической сыворотки не реже одного раза в 6 мес.Титрование комплементаГотовят исходное разведение комплемента (например, 1:250) с помощьюбуферного раствора, затем из него готовят ряд разведений в двух повторностях всоответствии с Таблицей 2:Для приготовления контрольных проб без гемолиза в три пробирки вносятпо 1,3 мл буферного раствора.Для приготовления контрольных проб с полным гемолизом в три пробиркивносят по 1,3 мл воды очищенной.49Таблица 2 – Порядок приготовления разведений комплементаНомера пробирокОбъем разведения комплементаОбъем буферного раствора,(например, 1:250), млмл10,11,220,21,130,31,040,40,950,50,860,60,770,70,680,80,590,90,4101,00,3111,10,2121,20,1Затем в каждую пробирку (с разведениями комплемента пробирки 1-12 иконтрольными пробами) добавляют по 0,2 мл гемолитической системы (состоитиз суспензии эритроцитов барана и гемолитической сыворотки), тщательноперемешивают и инкубируют в термостате при температуре 37,0±0,5 °С в течение60 мин; затем охлаждают 10 мин при температуре 5±3 °С и центрифугируют при3000 об/мин в течение 5 мин.Измеряютоптическуюплотностьнадосадочнойжидкостинаспектрофотометре в кюветах с толщиной слоя 10 мм при длине волны 541 нм.Раствор сравнения – буферный раствор.Рассчитывают степень гемолиза (Y) по формуле (3):пк,где: Ап – среднее значение оптической плотности испытуемой пробы;(3)50Ао – среднее значение оптической плотности контрольной пробы безгемолиза;Ак – среднее значение оптической плотности контрольной пробы с полнымгемолизом.С помощью программного обеспечения (например, с использованиемредактора Microsoft Officе Excel 2007) или на миллиметровой бумаге слогарифмическим масштабом строят график со значениями Y/(1-Y) по осиабсцисс и количеством разведенного комплемента (в мл) по оси ординат.Получают оптимизированную кривую (при построении графика учитываютсязначения степени гемолиза, находящиеся в диапазоне от 0,15 до 0,85; значения,находящиесязапределамиуказанногодиапазонанеучитываются),соответствующую нанесенным точкам, и определяют ординату для дозыкомплемента, приводящей к 50 % гемолизу, т.е.

Y/(1-Y)=1.Вычисляют активность комплемента в исходном растворе, выраженную вгемолитических единицах (СН50/мл), по формуле (4):СН50/мл =ВС,(4)где: В – величина, обратная степени разведения комплемента;С – объем разведенного комплемента (мл), вызывающий 50% гемолиз(Y/(1-Y)=1);5 – множитель для учета количества эритроцитов.Результат титрования комплемента считают достоверным при условии, чтонаклон прямой составляет от 0,15 до 0,40, предпочтительно в интервале 0,18-0,30.Определение антикомплементарной активности испытуемого образцаиммуноглобулинаПроверяютрНиспытуемогообразцаиммуноглобулинапотенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия». При рНменее 7,0 его доводят до значений 7,0-7,3 с помощью 0,1М раствора натриягидроксида (если нет иных указаний в ФС). Определяют содержание белка в51испытуемомобразцеиммуноглобулинаколориметрическимметодомсбиуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Определение белка».

Готовятпробу испытуемого образца иммуноглобулина, в зависимости от содержаниябелка. Например, при содержании белка в испытуемом образце иммуноглобулина50 мг/мл, к 0,2 мл раствора иммуноглобулина добавляют 0,6 мл буферногораствора. Если содержание белка в испытуемом образце иммуноглобулинаотличается от 50 мг/мл, используют большие или меньшие объемы испытуемогообразцаиммуноглобулина.Точныйобъемиспытуемогообразцаиммуноглобулина (V) в мл рассчитывают по формуле (5):V=где: 50 – необходимоесодержание,белка(5)виспытуемомобразцеиммуноглобулина, мг/мл;0,2 – объем испытуемого образца иммуноглобулина, взятый для испытания,мл;С – фактическоесодержаниебелкависпытуемомобразцеиммуноглобулина, мг/мл.Объем пробы доводят буферным раствором до 0,8 мл.Подготовку положительного и отрицательного контролей с использованиемстандартного образца иммуноглобулина человека (BRP или аналогичного)проводят в соответствии с инструкцией по его применению.Для приготовления пробы с контролем комплемента в пробирку вносят0,8 мл буферного раствора.Во все приготовленные пробы добавляют по 0,2 мл раствора комплемента,содержащего 100 СН50/мл.

Конечный объем проб – 1 мл.Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37,0±0,5 ºС в течение60 мин.По истечении срока инкубации готовят разведения 1:50 для проб сконтролем комплемента и испытуемым образцом иммуноглобулина. Разведенияконтрольных образцов (положительный и отрицательный контроль) проводят всоответствии с инструкцией по применению к стандартному образцу.52Проводят определение остаточной активности комплемента (в двухповторностях) в соответствии с Таблицей 3.Таблица 3 – Порядок подготовки проб для определения остаточной активностикомплементаНомера пробирокОбъем пробы, млОбъем буферного раствора, мл10,11,220,21,130,31,040,40,950,50,860,60,770,70,680,80,590,90,4101,00,3111,10,2121,20,1Для приготовления контрольных проб без гемолиза в три пробирки вносятпо 1,3 мл буферного раствора.Для приготовления контрольных проб с полным гемолизом в три пробиркивносят по 1,3 мл воды очищенной.Затем в каждую пробирку (пробирки 1-12 и пробирки с контрольнымипробами)добавляютпо0,2млгемолитическойсистемы,тщательноперемешивают и инкубируют в термостате при температуре 37,0±0,5 °С в течение60 мин, затем охлаждают 10 мин при температуре 5±3 °С и центрифугируют при3000 об/мин в течение 5 мин.Измеряютоптическуюплотностьнадосадочнойжидкостинаспектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 541 нм.53Раствор сравнения – буферный раствор.

Рассчитывают степень гемолиза (Y) поформуле (3) и строят график, как и при титровании комплемента.Если центрифугирование и/или считывание результатов не может бытьпроведено немедленно, пробы хранят при температуре 5±3 ºС не более 1 ч.Учет и интерпретация результатовВычисляют по формуле (4) активность комплемента в гемолитическихединицах (CH50/мл) для испытуемого образца иммуноглобулина, контрольныхобразцов (положительный и отрицательный контроли) и контроля комплемента.Антикомплементарную активность испытуемого образца иммуноглобулина(в %) и контрольных образцов (положительный и отрицательный контроли)вычисляют относительно активности в контроле комплемента, принятой за 100%,по формуле (6):АКАгде: b – активностькомплемента,(СН50/мл)(6)вконтролекомплемента,рассчитанная по формуле (4);a – активностькомплемента(СН50/мл)виспытуемомобразцеиммуноглобулина и в контрольных образцах (положительный и отрицательныйконтроли), рассчитанная по формуле (4).Антикомплементарную активность испытуемого образца иммуноглобулинав СН50/мг белка рассчитывают по формуле (7):АКА(СН50/мг белка)СН,(7)где: 20 СН50 – количество комплемента, взятого для испытания;b – активностькомплементарассчитанная по формуле (4);(СН50/мл)вконтролекомплемента,54a – активностькомплемента(СН50/мл)виспытуемомобразцеиммуноглобулина и в контрольных образцах (положительный и отрицательныйконтроли), рассчитанная по формуле (4);10 – количество белка иммуноглобулина (мг), взятого для испытания.Результаты испытания препарата иммуноглобулина считают достоверными,если:1.

Антикомплементарная активность отрицательного и положительногоконтролей находится в пределах, лимитируемых в инструкции по применению кстандартному образцу;2. Активность комплемента в контроле комплемента находится в пределахот 80 до 120 СН50/мл.В противном случае проводят повторный анализ.Примечания1. Приготовление буферных растворов (желатин-солевого или желатинбарбиталового).1.1. Приготовлениежелатин-солевогораствора.Вмернуюколбувместимостью 250 мл помещают 1 г желатина, прибавляют примерно 200 мл водыочищенной и оставляют набухать. Смесь нагревают при температуре 45±3 °С дополного растворения. Полученный прозрачный раствор охлаждают до комнатнойтемпературы.В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,50 г натрия хлорида,0,10 г кальция хлорида безводного, 0,04 г магния хлорида 6-водного, растворяют внебольшом количестве воды очищенной и прибавляют приготовленный растворжелатина.

Характеристики

Список файлов диссертации