Диссертация (1141351), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Анализатор разработан на основе последних достижений вобласти оптико-механических технологий, используемых в ИХА. Применяемыйметод ИХА обеспечивает обнаружение и количественную оценку содержания ПАВи их метаболитов.Количественныйанализоснованнафотометрическойрегистрацииизменений интенсивности окрашивания зон детекции реагента. Интенсивностьсигнала, измеряемая в милливольтах, сравнивается с данными калибровочнойкривой, полученной при анализе сертифицированного международного стандарта.50Калибровка выполняется изготовителем прибора и параметры калибровочнойкривой, построенной для каждой партии иммунохимических сенсоров, хранятся вэлектронном виде на магнитном чипе, нанесенном на тубу, в которой содержатсяиммунохимическиереагенты(тест-полоски).Специальныекалибраторы,представляющие собой растворы наркотических средств и психотропных веществ,в состав разработанной тест-системы не входят.Блокуправления(процессор)анализаторапозволяетпроводитьсамоконтроль прибора перед каждым измерением.
Анализатор имеет встроеннуюпамять и позволяет cохранять 100 результатов выполненных измерений, после чегофайлы можно перенести на персональный компьютер. Новые результатыизмерений будут записываться после использования функции «очистка памяти»(рис. 16).Рисунок 16 – Общий вид анализатора IK 200609 [24]А. 1. Подставка для тубы (с установленной тубой).
2. Дисплей. 3. Панель управления. 4.Фиксатор лотка для биосенсоров. 5. Лоток для биосенсоров. 6. Место для установкибиосенсора. 7. Отсек для аккумуляторных батарей типа АА.Б. Кейс для хранения и транспортировки анализатора и его составных частейВремя выдерживания реагента (по инструкции) в моче не менее 12 минут.Реагенты упакованы в пластиковые тубы по 50 штук в каждой.
На каждую тубунаклеена этикетка, на которой указаны название, количество реагентов в тубе,пределы количественного определения с указанием групп определяемых веществ,серия (лот) реагентов, срок годности, информация об изготовителе [24].51На обратной стороне этикетки находится магнитный чип, содержащийинформацию о количестве и параметрах реагентов, методе анализа икалибровочные характеристики (рис.17).Рисунок 17 – Реагенты для обнаружения синтетических катинонов в моче,лот 15120003Для ИХА доказательное значение имеет результат, при котором отсутствуютконтролируемые соединения в пробе. Отрицательный результат, получаемый напервом этапе исследования, имеет важное значение в практике диагностическогоисследования, так как дальнейшие анализы не выполняются, и дается заключениеоб отсутствии контролируемых веществ в пробе, что свидетельствует оботсутствии факта потребления НС, психотропного или другого токсическоговещества.
Для подтверждения обоснованности полученных результатов на всехреагентах имеется специальный детектирующий участок (зона контроля).Отсутствие окрашивания зоны контроля свидетельствует о том, что в данномбиологическом материале невозможно иммунохимическое взаимодействие иполученные результаты являются непредставительными или была нарушенапроцедура проведения анализа.При работе с анализатором аккумуляторные батареи типа АА (3 шт.)позволяют использовать анализатор с подключенным принтером несколько часовбез подключения к сети (220 В).
Реагенты в комплекте с портативными детектороми компьютером могут использоваться как в лабораторных условиях, так и дляпроведения анализа на местах сбора и регистрации проб.522.2.2 Оптимальные условия изолирования и анализа исследуемых веществРасчеты коэффициентов липофильности в зависимости от pH среды (logP,logD), значений рКа для α-PVP, MDPV и их основных метаболитов, влияющих навыборпараметровметодикипробоподготовкибиологическихобъектов,произведены с применением программы ACDLabs и платформы ACD/Percepta14.0.0 (Build 2726) и представлены в Приложении А-В.В аналитической практике ХТЛ пробоподготовка для анализа исследуемойгруппы соединений включает получение «щелочных» извлечений, при этом рНсреды объекта устанавливают 9-10 по лакмусовому индикатору кислотности.Учитывая представленные теоретические расчеты коэффициентов липофильностив зависимости от pH среды предположение о том, что нативные соединения α-PVP,MDPV и их основные метаболиты будут изолироваться из мочи при щелочныхзначениях рН, подтверждается.
Однако ряд метаболитов этих соединенийпроявляют свойства амфолитов, а у некоторых рН не влияет на процесс извлеченияизбиологическихобъектов.Этимтакжеможетобъяснятьсяразличиехроматографических профилей и интенсивность откликов основных метаболитовα-PVP в экспертных образцах при передозировке [18]. В дальнейшихэкспериментальных исследованиях с установлением различных по щелочности рНсреды мочи и анализе полученных данных по изолированию из них исследуемыхвеществ было установлено, что требуется ограничить диапазон рН и снизить егоуровень до интервала 8-9.Методика пробоподготовки мочиВ виалу на 10 мл с завинчивающейся крышкой вносят 3 мл мочи, добавляют100 мг смеси карбоната натрия и гидрокарбоната натрия в соотношении 1:2(уровень pH в пределах 8–9), а также 1–2 г хлорида натрия, перемешивают 10секунд на вортексе.
Cпомощью шприца для газовой хроматографии добавляют 10мкл раствора внутреннего стандарта – дифениламин в метаноле с концентрацией1мг/мл. К полученному раствору добавляют 2 мл смеси изопропанол-дихлорметангексан (1:7:2). Встряхивают на вортексе в течение 5 минут. Центрифугируют 353минуты при 1200g (1700 об/мин.). В виалу объемом 2 мл переносят верхнийорганический слой и упаривают досуха в токе сухого воздуха при нагревании 50оС.Затем сухой остаток перерастворяют в 100 мкл смеси этилацетат-метанол (1:1) ипереносят во вставку для виалы, позволяющей использовать автоматическийинжектор для ввода пробы в газовый хроматограф, закрывают виалу крышкой ианализируют [21].Условия хроматографирования: колонка капиллярная GsBP-5MS 30м×0,25мм, фаза – 0,25мкм, начальная температура колонки 70°С, выдержка 2 мин, нагревсо скоростью 20°С/мин до 280°С, выдержка 15 мин; газ-носитель – гелий, инжектор– splitless, скорость потока газа-носителя 1 мл/мин, температура квадрупольногоанализатора 150°С; температура ионного источника – 230°С.
Время включениякатодов и анализатора («задержка на растворитель») – через 3,51 мин после вводапробы, интервал сканируемых масс 50–550 m/z. Режим работы детектораустановлен по стандартной программе «Autotune». Детектирование производилипутем сравнения масс-спектра исследуемого пика с масс-спектром из библиотекмасс-спектров. При анализе использовали программу автоматизированнойсистемы масс-спектральной деконволюции и идентификации (AMDIS) ибиблиотеки масс-спектров NIST 14 и SWGDRUG (версия 3.2, октябрь 2017).
Дляидентификации образцов мочи с относительно низкой концентрацией аналитов илипри недостаточном количестве биологического объекта был выбран режимрегистрации масс-спектров по выбранным ионам (SIM).Были выбраны следующие ионы: 84 m/z, 121 m/z, 126 m/z, 149 m/z для MDPVи 77 m/z, 84 m/z, 105 m/z, 126 m/z, 188 m/z для α-PVP [8, 20].2.3 Операционные характеристики диагностических методов исследованияСуществуют различные способы оценки параметров производительности вкачественном анализе.
Для характеристики информативности диагностическихметодовисследованияоперационнымислужатхарактеристикамиобъективныеисследованияпараметры,(теста).именуемыеОперационныехарактеристики показывают насколько правильно и с какой точностью работаетданная тест-система. С помощью операционных характеристик можно рассчитать54необходимый уровень порогового значения.Кважнейшимоперационнымхарактеристикамметодадиагностикиотносятся: чувствительность; cпецифичность.К вспомогательным критериям информативности относятся: точность; прогностичность положительного и отрицательного результатов; отношениеправдоподобияположительногоиотрицательногорезультатов.При анализе любого исследования (теста) в практической медицине могутвстретиться только четыре варианта ответов:1) TP (англ.
True Positives, истинно положительные результаты) – верноклассифицированные положительные примеры;2) TN (англ. True Negatives, истинно отрицательные результаты) – верноклассифицированные отрицательные примеры;3) FP (англ. False Positives, ложноположительные результаты) отрицательные примеры, классифицированные как положительные (ошибка I рода, αошибки, «ложные тревоги»). Это ложное обнаружение, т.к. при отсутствиисобытия (потребления катинонов) ошибочно выносится решение о егоприсутствии (ложноположительные случаи);4) FN (англ.
False Negatives, ложноотрицательные результаты) положительныепримеры, классифицированные как отрицательные (ошибки II рода, βошибки). Это так называемый «ложный пропуск» – когда интересующее нассобытие ошибочно не обнаруживается.Чувствительность (англ. Sensitivity, Se) – это пропорция правильныхположительных результатов теста среди всех положительных, обследованныхреферентным методом.Это способность диагностического метода давать правильный результат,который определяется как доля истинно положительных результатов среди всех55проведенных тестов.Чувствительность показывает, какова будет доля выявления, например,катинонов у освидетельствуемых лиц, для которых данное исследование дастположительный результат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
