Диссертация (1141351), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Реакциям антиген-антителосвойственна высокая специфичность. Однако в некоторых случаях можетвозникать феномен, называемый перекрестной реактивностью (реагирование).Этот феномен возникает в том случае если антиген А имеет общие эпитопы сантигеном Б, тогда часть антител, специфичных к А, будет реагировать также с Б[13].НаиболеераспространеннымиметодамивИХАявляютсяпрямой(сэндвичный) и непрямой (конкурентный) методы исследования.В схеме прямого (сэндвичного) ИХА используется конъюгат специфическихантител с красящей меткой (в случае визуальной оценки результата), нанесенныйна мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы антитела,специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовыеантитела, специфические к первичным антителам. При попадании образца,содержащего анализируемое вещество, на мембране с конъюгатом происходитсвязывание аналита с конъюгатом Ат-метка.
Затем иммунный комплекс попадает втестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя36«сэндвич» Ат-Аг-Ат-метка. Избыток не связавшегося конъюгата связывается сантивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-хлиний на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствиианалита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только наконтрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярныхсоединений−вирусов, в т.ч.
ВИЧ; различных гормонов (например, в тестах набеременность), возбудителей инфекционных заболеваний.Схема сэндвичного ИХА не подходит для определения низкомолекулярныхвеществ, т.к. для образования сэндвича Ат-Аг-Ат антиген должен иметь, покрайней мере, две антигенные детерминанты (т.е.
центра связывания сантителами). Кроме того, из-за стерических затруднений образование такогодвойногокомплексаснизкомолекулярнымантигеноммаловероятно.Низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и,соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, которыйбудет «занят» аналитом в случаи присутствия последнего в образце. Поэтому дляанализа небольших молекул, в том числе наркотических средств и их метаболитов,используется другая схема – непрямой конкурентный ИХА.МетодконкурентногоиммобилизованногоИХАконъюгатаоснованнаконкуренции(ковалентно-связанныйаналитаналитасибелком-носителем) за ограниченное количество центров связывания специфическихантител, содержащихся в конъюгате Ат-метка.
Образец, содержащий аналит и(или) его метаболиты, движется по пористой мембране тестовой полоски сфронтом жидкости за счет капиллярных сил. При прохождении стартовой линиикомпонентывступаютвреакциюсконъюгатомАт-метка,образуяиммунокомплекс «антиген-антитело». Далее иммунокомплекс проходит черезтестовую зону (Т), где иммобилизован конъюгат и конкурирующее вещество.Иммунокомплекс не может связаться и вступить в реакцию с этим конъюгатом изза стерических затруднений. Окрашенная полоса на уровне маркировки Т (тест) невыявляется, что свидетельствует о наличии аналита в пробе (рис.
11). Далее37иммунныйкомплекссвязываютантивидовыеантитела,находящиесявконтрольной зоне (К). Появление окрашенной полосы розового цвета в зонеконтроля свидетельствует о правильности проведения анализа и правильностиработы компонентов полосок.Рисунок 11 – Результат реакции при наличии в образце анализируемого веществаКогда концентрация ниже порогового уровня или аналит (или егометаболиты)отсутствуютванализируемомобразцемочи,антиген,иммобилизованный в тестовой зоне (конъюгат), вступает в реакцию с антителами,меченными коллоидным золотом (конъюгат Ат-метка), в результате чеговыявляется окрашенная полоса на уровне маркировки тестовой зоны. Такимобразом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) являетсяотрицательным результатом исследования.
(рис. 12).Схема оценки результатов ИХА наркотических веществ представлена нарисунке 13. Результат теста является недействительным при отсутствииконтрольной линии, т.к. этот факт может свидетельствовать о незавершеннойпроцедуре анализа, либо о том, что иммунохимическая реакция не прошладолжным образом по какой-либо причине (из-за испортившихся иммунореагентовили несоблюдения инструкции по применению теста).38Рисунок 12 – Результат реакции при отсутствии в образце анализируемого веществаРисунок 13 – Схема оценки результатов конкурентного метода ИХАНаиболее часто используемой меткой в ИХА является частицы коллоидногозолота диаметром от 5 до 50 нм, которые образуют линии темно-бурого (или темнорозового) цвета [19].Иммунная хроматография не требует дополнительных реагентов в отличиеот других методов иммуноанализа, поскольку все необходимые компоненты ужезаранее нанесены производителем на мембрану.
Контакт абсорбирующеймембраны тест-полоски с образцом инициирует всю последовательностьпроцессов, описанную выше. Возможность в кротчайшие сроки получить39результаты в виде детектируемой качественной «да-нет» информации на этапескрининга объясняет причину столь интенсивного развития данного направленияи коммерческого производства доступных тестов [101].На сегодняшний день существуют коммерчески доступные цифровыеоптическиедетекторыдляиммунохроматографическихтестов[107].Целесообразность использования портативной фотометрической регистрирующейтехникиприпроведениианализовопределяетсяисключениемэлементасубъективности, позволяет сохранять результаты тестирования в виде первичногодокумента и (или) обработанных на компьютере данных.1.3.2 Инструментальные методы анализа подтверждающего этапа ХТИХромато-масс-спектрометрия является основным методом в диагностикепотребления наркотических средств, сильнодействующих и психотропныхвеществ (и/или их метаболитов) в современном ХТА благодаря высокойспецифичности метода, позволяющей идентифицировать аналит.ГХ-МС – комбинированный метод, основанный на сочетании двуханалитических методов: капиллярной газовой хроматографии (возможностьселективного разделения веществ) и метода масс-спектрометрии (возможностьселективного и чувствительного детектирования и идентификации компонентов).Наиболее информативные результаты получают в режиме полного сканирования срегистрацией масс-спектра.
Использование режима мониторинга выбранных ионовпозволяет повысить чувствительность определения (на порядок величины).Методика ГХ-МС анализа при ХТИ основана на идентификацииопределяемыхвеществ,жидкость/жидкостнойиливыделенныхизтвердофазнойбиологическихэкстракциейсобразцовпоследующейдериватизацией (при необходимости) и хромато-масс- спектрометрическимдетектированием.Определяемыевеществаидентифицируютподвуманалитическим параметрам: время хроматографического удерживания и массспектр.С использованием методики ГХ-МС анализа полная ионная хроматограмма(TIC) и масс-спектр с ионами m/z 126, 84, 121, 149 характерен для MDPV, а40типичные ионы масс-спектра m/z 140, 98 и 206 характерны для 2-оксо-MDPV (рис.14).Деградация пирролидинового кольца до первичного амина, по-видимому,является общим метаболическим путем для -пирролидинофенонов, как это былоранее показано для α-PVP [66].Анализ экстрактов методом полного сканирования ГХ-МС выявил наличиеα-PVP и его метаболитов: 2-оксо-α-PVP и OH-α-PVP.TIC и ионы масс-спектра m/z 77, 105, 126 и 188 характерны для α-PVP(целевая библиотека MPW 2011).TIC и типичные ионы масс-спектра m/z 77, 86, 98, 105 и 144 говорят оналичии метаболита 2-оксо-α-PVP (рис.
15).Описанные процедуры систематического токсикологического анализа(systematictoxicologicalanalysis,STA)ГХ-МСпоказывают,чтомасс-спектрометрия с выбранными ионами m/z 126 и 140 указывают на наличие MDPVи его метаболитов. Ион m/z 126 при мониторинге указывает на присутствиекомпонентов с неизменным кольцом пирролидина, а с m/z 140 для соединений соструктурой 2-оксо [65]. Таким образом, среди широко применяемых в химикотоксикологическом анализе методов только масс-спектрометрия позволяетпроводить идентификацию вещества в биологическом материале.41Рисунок 14 – Результаты анализа образца мочи человека, содержащие MDPV и егометаболиты. Полные ионные хроматограммы (сверху), масс-спектры (внизу) ипредлагаемая структура с фрагментацией.
A) спектры 1 и 2 показывают данные анализамочи после щелочного извлечения жидкость-жидкостной экстракцией. B) Спектры 3 и 4показывают данные ацетилированных метаболитов после кислотного гидролиза (25%соляная кислота) и щелочной экстракции мочи [65]42Рисунок 15 – Результаты анализа образца мочи человека, содержащие α-PVP и егометаболиты [66]1.4 Уровни порогового значения («cut-off») в системе ХТАПорог обнаружения в методе представляет собой нижний пределчувствительности метода, позволяющего с высокой степенью вероятностидифференцировать объекты, содержащие и не содержащие искомый аналит, икоторый характеризуется его концентрацией в объекте, например, для методовхроматографического разделения, а вот уже для иммунохимических технологийпри исследовании биологических объектов на наличие наркотиков он же ужевыражен уровнем «функциональной чувствительности» («cut-off»), т.е.
уровнем,так называемой достоверно определяемой отсечки возможности влияниябиологической матрицы, сопутствующих аналитов и даже минимальныхконцентраций исследуемого компонента. Следовательно, уровень пороговогозначенияслужитточкойпринятиярешениядляпредварительногоилиподтверждающего метода и вынесения заключения о наличии или отсутствиивещества в пробе. В зависимости от установленной в объекте исследованияконцентрации вещества должно быть вынесено одно из двух возможныхзаключений: результат проведённого анализа положительный или отрицательный43[21]. Таким образом, уровень порогового значения («cut-off») – минимальныйустановленный уровень концентрации вещества, при превышении которого вобъекте анализа результат исследования считается положительным. На практикеэто позволяет говорить, что отрицательный результат не отрицает возможностииспользования или воздействия на человека ПАВ [25], но это относительно инедостоверно, так как в этих пределах высоко влияние биоматрицы исопутствующих веществ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
