Диссертация (1141351), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В щелочной моче (pH8) при 32°C значительные потери (> 20%) наблюдались в течение нескольких часовдля большинства соединений из этой группы. Напротив, все аналиты былистабильны в замороженной и охлажденной моче при рН 4.Катиноны, содержащие третичный амин (пирролидиновая группа), былизначительно более стабильными, чем их аналоги, содержащие вторичный амин.Метилендиоксигруппа также оказывала значительное стабилизирующее действиекак на третичные, так и на вторичные амины.Стабильность синтетических катинонов при pH 8 варьировалась от 9 ч (3фторметкатинон) до 4,3 месяцев (MDPV), тем самым демонстрируя зависимостьстабильности аналита от его структуры.
Главный стабилизирующий эффектоказывают пирролидиновое кольцо и метилендиокси-группа, для сравнения α-PVPбыл стабилен в течение 1,3 месяца при pH 8 [63, 64].Johnson и Botch-Jones [69] показали, что MDPV будет стабилен в крови прикомнатной температуре, +4°C и −20°C до 14 дней.30Оптимальные условия хранения – это хранения пробы с фторидомнатрия/оксалатом калия при температуре −20°С [43].MDPV и его метаболиты стабильны в плазме крови при комнатнойтемпературе (24 часа), 4°C (72 часа), и после трех циклов замораживанияоттаивания [52].Проверена стабильность мочи, содержащей катиноны, в течение 3 месяцевпри температуре –20°C; большинство катинонов были стабильны (78,3–106%) заисключением буфедрона, 4-FMC и пентилона (36,3–62,1%) [33].Эти результаты подчеркивают необходимость соблюдения надлежащихусловий при хранении и транспортировки биообъектов с целью сохранностианалитов.1.3 Методы химико-токсикологических исследованийОтличительной особенностью химико-токсикологического анализа (ХТА)является определение экзогенных веществ в объектах, представляющих собойсложные многокомпонентные биоматрицы.
В основе методологии анализа насодержание ПАВ положен метод скрининга, используемый при ненаправленноманализе. При направленном анализе, как правило, применяются частные методикиопределения аналитов.Выбор аналитических методов для скрининга определяется, в первуюочередь, целью анализа – минимизировать количество отрицательных и получитьмаксимальное количество положительных результатов, и связан с такими важнымипараметрами исследования, как чувствительность и специфичность.Основнымидокументами,химико-токсикологическихрегламентирующимилабораторийпридеятельностьвыполненииврачейхимико-токсикологических исследований в Российской Федерации, являются дваведомственных приказа: ПриказМинистерстваздравоохраненияисоциальногоразвитияРоссийской Федерации «Об организации проведения химико-токсикологическихисследований при аналитической диагностике наличия в организме человека31алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ» от27 января 2006 года № 40) [3]. ПриказМинистерстваздравоохранения«Опорядкепроведениямедицинского освидетельствования на состояние опьянения (алкогольного,наркотического или иного токсического)» от 18 декабря 2015 г.
№ 933н (далееПриказ Минздрава России от 18.12.2015 № 933н) [4].В соответствии с вышеуказанными нормативными документами дляобнаружения наркотических средств, психотропных веществ и их метаболитовприменяется научно обоснованная и принятая в мировой практике схемалабораторных исследований, выполняемых в две стадии. На первой стадииприменяются методы иммунохимического анализа, позволяющие выявлятьобразцыбиологическогоконтролируемыхвеществматериала,илиихвкоторыхметаболитовпредполагается(маркеровналичиепотреблениянаркотических средств и психотропных веществ). Результаты, полученные напервой стадии анализа, имеют доказательное значение только при отсутствиицелевых токсикантов и их метаболитов в пробе. Доказывание наличиянаркотических средств, психотропных, сильнодействующих веществ и ихметаболитов (или их отсутствие) осуществляется на второй стадии анализа, накоторой исследуются образцы, имеющие положительный результат, полученныйна первой стадии.
Для этого применяются методы газовой и высокоэффективнойжидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС,ВЭЖХ-МС/МС). Для идентификации наличия целевых аналитов в биологическомматериале используются также специализированные библиотеки масс-спектров,входящие в состав программного обеспечения, указанных аналитическихкомплексов.В таблице 6 приведена сравнительная оценка иммунохимических ихроматографических методов исследования.В качестве основных скрининговых методов анализа при проведении ХТИприменяются иммунохимические методы, а в качестве подтверждающих методовисследования используются ВЭЖХ/МС-МС, ГХ-МС.32Подтверждающиечувствительности,методычтобыдолжныуменьшитьбытьвышеколичествоилиравнымиположноотрицательныхрезультатов, но обязательно должны быть выше по специфичности, для того чтобыснизить количество ложноположительных результатов [30].Таблица 6 – Сравнительная оценка методов анализаПреимуществаНедостаткиИммунохимические методы1.
Объективность результатов.2. Хорошая чувствительность.3. Полуколичественная оценка.4. Простота выполнения.5. Умеренная стоимость реагентов.6. Быстрота анализа.1.Перекрестно реагирующие веществамогут дать ложноположительныйрезультат.2.Групповой метод не различаетиндивидуальных соединений внутригруппы.Хроматографические методы1. Хорошая чувствительность.1.Требуется высококвалифицированный2.
Высокая специфичность.персонал.3. Количественное определение.2. Относительная длительность анализа.3. Иногда зависит от субъективнойинтерпретации результатов.1.3.1 Иммунохроматографический метод анализа на этапе скринингаИммунохроматографический анализ (ИХА) как скрининговый методполучил широкое применение в различных областях медицины и народногохозяйства (медицинская диагностика, терапевтический мониторинг, банки крови иплазмы, судебная медицина, экологический мониторинг, продукты питания,сельское хозяйство, самодиагностика и др).Тест-полоски для ИХА являются чрезвычайно удобными и простыми виспользовании, однако они имеют сложное строение и процесс разработки каждоговида ИХА является чрезвычайно трудоемким и высокотехнологичным.ИХА является самым распространенным методом скрининга при выявленииПАВ и заслуживает пристального внимания.
Преимущества метода: быстрота и легкость в использовании; малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;33 дешевизна для производителя и потребителя; возможность производства тестов в больших объемах; простота чтения и интерпретации результата; высокая чувствительность и вопроизводимость; возможность количественного определения в ряде анализов; возможность использования портативных ридеров; возможность мультианализа.ИХА-тест (иммунохроматографическая полоска) включает в своем составеследующие основные элементы: пластиковая подложка, на которую наклеены всеостальные компоненты теста, фильтра (прокладки для образца), мембрана сконъюгатом, хроматографическая мембрана, содержащая одну или несколько зонзахвата иммунных комплексов и контрольную зону захвата, впитывающаяпрокладка (абсорбирующая мембрана) (рис.
9). Часто, особенно в случаях, когданедоступны большие количества биообразца для анализа, например, дляопределения наркотических веществ в слюне, тест-полоска может быть закрепленав пластиковом корпусе, у которого имеются приемное и тестовые «окна». Прианализе на несколько групп ПАВ одновременно, для удобства применяют мультикассеты, в корпус которых помещены сразу несколько тест-полосок.Рисунок 9 – Схематическое изображение иммунохроматографической тест-полоскиИХА основан на принципе тонкослойной хроматографии и специфическойреакции антиген-антитело. Антитела (иммуноглобулины) являются относительнокрупными (~150 кДа – IgG) гликопротеинами, продуцируемые В-лимфоцитами(плазматическими клетками) и имеющими сложное строение.
Состоят из двух34идентичныхтяжёлых(H-цепи)издвухидентичныхлёгких(L-цепей)полипептидных цепей, связанных дисульфидной связью. Эти цепи имеютконстантные (С) и вариабельные (V) участки. К тяжёлым цепям ковалентноприсоединены олигосахариды. При помощи протеазы папаина антитела можнорасщепитьнадваFab-фрагмента(англ.fragmentantigenbinding−антигенсвязывающий фрагмент) и один Fc-фрагмент (англ.
fragment crystallizable −фрагмент, способный к кристаллизации). По типу тяжелой цепи различают 5классов иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Общий план строения антител(иммуноглобулинов) представлен на рисунке 10.Рисунок 10 – Общий план строения иммуноглобулинов: 1) Fab-фрагмент; 2) Fcфрагмент; 3) тяжёлая цепь; 4) лёгкая цепь; 5) антиген-связывающийся участок;6) шарнирный участокАнтителараспознаютнеотдельныехимическиегруппы,апространственную форму антигенов. Было установлено, что каркасные участкиFab-фрагмента молекул антител, обычно не принимающие участие в связыванииантигена, имеют существенное значение для укладки домена, которая обеспечиваетадекватную конформацию (комплементарность) антиген-связывающего центраантитела (паратопа) с антигенной детерминантой (эпитопом). Домены антител –35компактные структуры, скрепленные дисульфидной связью.
А множествонековалентных связей с антигеном образуют отдельные аминокислотные остаткигипервариабельных участков, сосредоточенных на концах Fab-ветвей [23]. Fcфрагмент может связывать комплемент, взаимодействует с мембранами клеток иучаствует, например, в переносе IgG через плаценту.Активный центр антитела отвечает за распознавание и связываниекомплементарногоантигена,формируетсязасчетпространственноговзаимодействия VH- и VL-доменов. Специфичность антитела при этомопределяется аминокислотным строением полипептидной цепи V-доменов обеихцепей.Взаимодействие антиген-антитело обратимо и скорость диссоциациикомплекса зависит от аффинности (аффинитета) антитела (связь одногоантигенсвязывающего центра с индивидуальным эпитопом антигена, т.е. сродствоантител к антигенам) и его авидности (прочность связи антитела с антигеном иколичествосвязанногоантигена антителами).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
