Диссертация (1141252), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Миронова.Том I [57], а также на основании руководств по валидации биоаналитическихметодик Food and Drug Administration (FDA) [79] и European Medicines Agency(EMA) [80] по следующим характеристикам:- селективность;- линейность;- правильность (на уровнях inter-day и intra-day);- прецизионность (на уровнях inter-day и intra-day);46- предел количественного определения;- перенос пробы;- стабильность растворов.СелективностьВыбранный аналитический метод должен иметь достаточное разрешениепиков аналита и внутреннего стандарта с пиками эндогенных компонентовматрицы или других компонентов образца.Для определения селективности проводили анализ 6 образцов чистойплазмы, образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора тиозонидав диапазоне концентраций 1нг/мл – 1000 нг/мл. На хроматограммах образцовчистойплазмыненаблюдалосьпиковсовременемудерживания,соответствующим времени удерживания тиозонида.
Хроматограмма образцачистой плазмы, не содержащей стандартного образца тиозонида, представлена наРисунке 2. Хроматограмма образца плазмы, содержащей раствор стандартногообразца тиозонида с концентрацией 50 нг/мл, представлена на Рисунке 3.Рисунок 2. Хроматограмма чистой плазмы, не содержащей раствор стандартногообразца тиозонида.47Рисунок 3.
Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 50 нг/мл.Разрешение между пиком бланка и пиком аналита (RS) рассчитывали по формуле:RS = 2*(TR2- TR1) / (W1+W2), гдеTR1 – время удерживания пика аналита;TR2 – время удерживания пика бланка;W1 – ширина пика аналита у основания;W2 – ширина пика бланка у основания.Разрешение между пиком бланка и пиком аналита имеет величину 3,149,что соответствует нормам, критерий пригодности – разрешение не менее 3.ЛинейностьДля определения линейности проводили анализ 9 образцов чистой плазмы сприбавлениемрастворастандартногообразцатиозонидадополученияконцентраций: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл,500 нг/мл и 1000 нг/мл.
Каждая модельная смесь анализировалась 3 раза.Полученные значения площадей пиков и концентраций тиозонида представлены вТаблице 2.48Таблица 2№ модельной Площадьсмесипика1100123456CСфактическая, рассчитанная,нг/млнг/мл10,998227ε, %0,18%110311,008436-0,84%110711,022048-2,20%215654,5917958,16%217854,6666616,67%211854,46248110,75%3475109,0803529,20%3536109,2879357,12%3505109,1824428,18%76542523,301496,79%77012523,461436,15%74912522,74689,01%145905046,90476,19%144805046,530376,94%147695047,513834,97%2988010098,936571,06%30728100101,8223-1,82%30931100102,5131-2,51%4978970002250235,47175,81%72261250243,15912,74%69315250233,13396,75%157594500533,5473-6,71%160873500544,7057-8,94%153633500520,068-4,01%2880101000977,3532,26%2851281000967,54553,25%29761810001010,049-1,00%По полученным значениям был построен калибровочный график совместнос уравнением калибровочной кривой (y = 0,0034030x - 2,745), приведены наРисунке 4.Рисунок 4.
Калибровочный график зависимости площади пика тиозонида от егоконцентрации в плазме (нг/мл).50Критериями приемлемости являются как коэффициент корреляции (R2>0,998), так и свободный член a в уравнении полученной прямой y=bx+a, которыйне должен превышать 5% от площади пика в модельной смеси с ожидаемойконцентрацией. В данном случае как видно по полученному уравнениюкалибровочной кривой y = 0,0034030x - 2,745 свободный член имеет величину помодулю 2,745 и не превышает 5% от площади пика аналита с концентрацией 1нг/мл.Концентрационный диапазон подбирают таким образом, чтобы обеспечитьадекватное описание фармакокинетики определяемого вещества. Примерысоответствующих хроматограмм представлены на Рисунках 5-13.Рисунок 5.
Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 1 нг/мл51Рисунок 6. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 5 нг/млРисунок 7. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 10 нг/мл52Рисунок 8. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 25 нг/млРисунок 9.
Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 50 нг/мл53Рисунок 10. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 100 нг/млРисунок 11. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 250 нг/мл54Рисунок 12.
Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 500 нг/млРисунок 13. Хроматограмма плазмы, содержащей раствор стандартного образцатиозонида с концентрацией 1000 нг/мл.Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанных поуравнению линейной зависимости, от фактических значений, приведены вТаблице 3.55Таблица 3Отклонения концентраций калибровочных растворов тиозонида отфактических значенийCСфактическая, рассчитанная,нг/млнг/мл10,86ε, %Норма-14,01Не более 20%54,50-10,10109,04-9,652523,42-6,325047,29-5,4110099,93-0,07250238,04-4,79500539,555,911000988,47-1,15Не более 15%Полученные отклонения соответствуют нормам (не более 20 % для нижнегодиапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек).
Исходя изполученных данных, методику можно считать линейной в пределах от 1 нг/мл до1000 нг/мл.Правильность и прецизионностьПроводили анализ 4 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартногораствора тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл,1000 нг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз. Исследование проводилив течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter-day). Для полученных значенийконцентрацийбылирассчитанывеличиныотносительногостандартногоотклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε, %), которые приведены вТаблицах 4 и 5.56Таблица 4Правильность и прецизионность методики (intra-day)Введено(нг/мл)1101001000ПлощадьпикаНайдено(нг/мл)11791,1311841,1511991,2011320,9711931,18391810,5636919,78404911,01388610,45395310,6831255104,662948698,5730613102,4530834103,212896096,76288025988,52282947971,042953781013,832979081022,543006011031,81Найдено(нг/мл),среднеезначение(n=5)RSD, %(n=5)ε, %1,1268,112,6010,4964,34,96101,133,31,131005,52,50,55557Таблица 5Правильность и прецизионность методики (inter-day)Введено(нг/мл)1101001000ПлощадьпикаНайдено(нг/мл)11901,1711521,0410740,7710940,8410880,82441512,27385410,34396510,72414211,3332068,112946898,512966099,172624487,4132344108,4131095104,112984781024,52928131005287703987,41288757991,04287151985,51Найдено(нг/мл),среднеезначение(n=5)RSD, %(n=5)ε, %1,02716,1252,70010,52510,2235,250100,3265,7410,3261002,1162,0260,21258Полученные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %) соответствуют нормам FDA [79] и EMA [80](не более 20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальныхконцентраций).Также были рассчитаны величины средних значений времени удерживаниядля каждого стандартного раствора с рассчитанным значением величиныотносительного стандартного отклонения и относительной погрешности, которыеприведены в Таблице 6.Таблица 6Введено, (нг/мл)1101001000Время удерживания(мин), среднеезначение (n=5)1,9952,0041,9971,991RSD, %0,272ε, %-0,162Предел количественного определенияПредел количественного определения (ПКО) методики определяется посоотношению сигнал/шум не менее 10.
Для того чтобы подтвердить не случайныйхарактер полученной величины рассчитываются значения RSD и ε, значениякоторых не должны превышать более 20 %. Предел количественного определенияметодики составил 1 нг/мл. Величина соотношения сигнал/шум составила 10:1.Хроматограмма, демонстрирующая ПКО методики, приведена на рисунке 14.59Рисунок 14. Хроматограмма плазмы, содержащей тиозонид на уровне ПКОСтабильностьСтабильность была подтверждена для стандартных растворов тиозонида(при хранении раствора в течение 14 дней при температуре от 2 до 8 оС),кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 24 и 48 часовпри анализе на следующий день при температуре 15 оС) на уровнях концентраций1нг/мл и 1000 нг/мл. Образцы выдерживали 3 цикла заморозки-разморозки.Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на 10 %.Для исследования долговременной стабильности образцы плазмы на уровнеконцентрации 100 нг/мл были помещены в морозильник при температуре отминус 75 до минус 80 оС для последующего анализа спустя 1 месяц послезаморозки.
Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на 10%.Перенос пробыПри последовательном вводе пробы с концентрацией тиозонида 100 нг/мл ичистойплазмынахроматограммечистойплазмыотсутствовалипики,соответствующие тиозониду. Перенос пробы отсутствовал. Соответствующаяхроматограмма приведена на Рисунке 15.60Рисунок 15. Хроматограмма образца чистой плазмы, полученная после анализапробы с концентрацией тиозонида 100 нг/млТаким образом, разработана и валидирована методика количественногоопределения инновационного противотуберкулезного препарата тиозонида вплазме крови человека методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.Полученные данные демонстрируют, что разработанная методика являетсяселективной, точной, прецизионной и линейной, соответствует по всемпараметрам требованиям руководств FDA [79] и EMA [80] по валидациибиоаналитических методик.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
