Диссертация (1141252), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

В качестве биологической модели27использовали самцов-мышей массой 22 г. Оценивали противотуберкулезныйэффект тиозонида в сравнении с эффективностью ПТП первого ряда (изониазида,рифампицина, пиразинамида и этамбутола), а также изучали взаимодействиепрепарата тиозонид с ПТП первого ряда.В ходе исследований in vitro было выявлено, что тиозонид обладалантимикобактериальным эффектом, сравнимым с ингибирующим действиемизониазидаилабораторногорифампицина,штаммапротивотуберкулезнымингибировалМБТпрепаратам,росткультурывирулентногочувствительногоH37Rv,культурыштаммаМБТковсемCN-40смоноустойчивостью к изониазиду и культуры штамма МБТ MS-115 смножественной лекарственной устойчивостью.Результаты исследований in vivo показали, что продолжительность жизниэкспериментальных животных, получавших монотерапию препаратом тиозонид,не отличалась от продолжительности жизни животных, получавших изониазид ирифампицин.Совместнаятерапиятиозонидомсэтионамидомитиозонидомспиразинамидом привела к достоверному увеличению продолжительности жизниэкспериментальных животных этих групп по сравнению с монотерапиейпиразинамидом и этионамидом.Показатели КОЕ МБТ в легких экспериментальных мышей, принимавшихтиозонид, свидетельствовали об эффективном противотуберкулезном эффекте invivo в дозе 25 мг/кг, сравнимом с показателями КОЕ МБТ в легких животных,получавших рифампицин в аналогичной дозе.

В двух сериях эксперимента остройтоксичности на мышах препарат относится к IV классу опасности [65].Проводились исследования фармакокинетики тиозонида в виде изомера Р2(R/S-изомерия) при однократном внутрижелудочном введении на мини-свиньяхСветлогорской популяции [66]. Концентрация тиозонида в плазме крови минисвиней определялась методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором,предел количественного определения методики составлял 2 нг/мл. В качествебиологического материала использовали кровь и мочу мини-свиней.

Однако в28пробах мочи тиозонид не был обнаружен. Динамика концентрации тиозонидаопределялась в сыворотке крови при трех дозировках: 100 мг, 200 мг и 400 мг.График отбора проб крови для изучения фармакокинетики был следующим: 0.5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96 часов. Индивидуальные профили измененияконцентраций тиозонида в сыворотке крови во времени, заpегистpиpованныепосле внутрижелудочного введения тиозонида Р2 в вышеуказанных дозах,хаpактеpизовалимаксимальнойконцентрациейвеществаивременемеедостижения, площадью под кривой «концентрация – время» в пределах от нуля домомента отбора последней пробы крови (96 ч), рассчитанной методом трапеций, атакже периодом полувыведения. При обработке полученных результатовоценивали среднее значение, стандартное отклонение и стандартную ошибку,коэффициент вариации, минимальное и максимальное значения.Исследования показали, что после внутрижелудочного введения животнымкинетика препарата характеризуется быстрым поступлением тиозонида всистемный кровоток и длительной циркуляцией в нем (48 и более часов).Максимальнаяконцентрациявсывороткекровиживотныхпослевнутрижелудочного введения составила в среднем 31,7±6,0 нг/мл, 118,7±62,0нг/мл, 1043,3±66,1 нг/мл для дозировок 100 мг, 200 мг, 400 мг соответственно идостигалась в диапазоне 1-8 часов.

Значения концентраций тиозонида в каждойвременной точке колебались в значительных пределах (значение коэффициентавариации доходило до 170%). Период полувыведения колебался в интервале 20-45часов. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат быстро и полновсасывается в системный кровоток, длительно циркулирует в организмеживотных.Коллективом наших сотрудников проводилось исследование двух изомеровтиозонида – тиозонид Р1 и тиозонид Р2 (R/S-изомерия). В результате серииэкспериментовбыларазработанаметодикаколичественногоопределениятиозонида Р1 и тиозонида Р2 в биологических объектах (биологическая жидкость– плазма крови; органы - мышцы, сальник, печень, почки, легкие) методомжидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на приборе29«Agilent 1200» (США). Оптимальными были признаны следующие условияизвлечения и хроматографирования тиозонида Р1 и тиозонида Р2.Извлечение тиозонида Р1 и тиозонида Р2 из плазмы крови:200 мкл плазмы помещали в микропробирки Eppendorf, прибавляли 300 мклацетонитрила, встряхивали на шейкере при скорости 2500 об/мин в течение 5минут, затем центрифугировали в течение 10 минут при 13200 об/мин.

Далееотбирали 200 мкл центрифугата в виалу, добавляли 200 мкл воды, тщательноперемешивали на шейкере и помещали в автосамплер.Извлечение тиозонида Р1 и тиозонида Р2 из органов:точную навеску гомогенизированного органа помещали в микропробиркиEppendorf, добавляли 2 мл этанола подкисленного ТФУ (100:1), встряхивали нашейкере при скорости 2500 об/мин в течение 10 минут, затем помещали вультразвуковую баню на 10 минут, встряхивали на шейкере при скорости 2500об/мин в течение 10 минут. Далее проводили настаивание в течение 30 минут,снова встряхивали на шейкере в течение 5 минут, полученный экстрактцентрифугировали при скорости 13500 об/мин в течение 10 минут.

Центрифугатпереносили в виалу и помещали в автосамплер.Условия хроматографированияРазделение проводили на колонке «ZORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» притемпературе колонки 400С. В качестве подвижной фазы использовали смесьацетонитрила и 0,1 % раствора трифторуксусной кислоты (рН 2,6) в соотношении60:40. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Детектор: масс-спектрометрический,квадруполь.Ионизация:электрораспылительныйвариант(ElectrosprayIonization,ESI). Напряжение на капилляре 4000V. Детектирование проводили вSIM режиме по ионам 559,1 (Р1) и 561,1 (Р2).

Время удерживания тиозонида Р1составило 3,59 мин; время удерживания тиозонида Р2 составило 4,41 мин.Предел обнаружения тиозонида Р1 и тиозонида Р2 в биологических объектахсоставил 2 нг/мл.301.5 ЗаключениеАнализ литературных данных показал, что с начала 90-х годов в РоссийскойФедерации отмечается отчетливая тенденция к ухудшению эпидемиологическойситуации по туберкулезу. Наиболее вероятной причиной этого являетсялекарственнаярезистентностьМБТкосновнымпротивотуберкулезнымпрепаратам.Распространение штаммов туберкулеза с множественной и широкойлекарственной устойчивостью представляет собой серьезную угрозу здоровьюобществаитребуетновыхподходовклечениюзаболевания.Курсыпротивотуберкулезной химиотерапии, которая является основным компонентомлечения туберкулеза, включают в себя продолжительный (от 6 месяцев) приембольшого количества ПТП (от 3 и более в зависимости от степени тяжести ихарактера заболевания).

Нарушение комплаентности, досрочное прекращениелечения в силу появления тяжелых побочных эффектов ПТП, приводит кснижению эффективности противотуберкулезной терапии, и, как следствие, краспространению лекарственно устойчивых форм туберкулезной инфекции.ПациентамсМЛУтуберкулезомиШЛУтуберкулезомнеобходимыиндивидуальные режимы противотуберкулезной терапии, которые включаютподбороптимальнойкомбинациилекарственныхпрепаратовсучетомлекарственной устойчивости МБТ.Таким образом, для национальных программ борьбы с туберкулезом сталаочевидной потребность в уменьшении сроков химиотерапии и использованииновых противотуберкулезных препаратов.Анализ литературных данных доклинических исследований тиозонида наживотных позволил оценить токсические свойства препарата и прогнозироватьвысокую степень безопасности его применения в клинических исследованиях.31В серии экспериментов in vitro доказан антимикобактериальный эффекттиозонида, сравнимый с таковым у изониазида и рифампицина, а такжеэффективность в отношении вирулентного штамма МБТ H37Rv, чувствительногоко всем противотуберкулезным препаратам, культуры штамма МБТ CN-40 смоноустойчивостью к изониазиду и культуры штамма МБТ MS-115 смножественной лекарственной устойчивостью.

По результатам исследований invivo выявлено, что тиозонид достоверно увеличивал продолжительность жизниэкспериментальных животных при совместной терапии с этионамидом и спиразинамидом. В двух сериях эксперимента острой токсичности на мышахпрепарат относится к IV классу опасности [65].Результаты фармакокинетических исследований тиозонида демонстрируют,что тиозонид быстро и полно всасывается в системный кровоток и длительноциркулирует в нем (48 и более часов) [66].По результатам доклинических исследований предположительно Тиозониддолжен обеспечить:1) повышение эффективности стандартной химиотерапии лекарственночувствительного туберкулеза;2) повышение эффективности химиотерапии туберкулеза с множественнойи широкой лекарственной устойчивостью микобактерий;3) уменьшение общей продолжительность эффективной терапии МЛУтуберкулезаи/илизначимоеснижениеобщегоколичестваназначаемыхпрепаратов.Тиозонид представляет собой инновационное лекарственное средство, влитературе отсутствуют данные по биоаналитическим методикам определениятиозонида в плазме крови человека.

Имеющиеся результаты доклиническихисследований позволяют сделать заключение о безусловной перспективностидальнейшего изучения тиозонида в качестве противотуберкулёзного препарата.32ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Оборудование и реактивы жидкостнойхроматографAgilent1200смасс-спектрометрическимдетектором MS 6120, AgilentTechnologies, США; весы аналитические OHAUS DV 214C, Китай; портативный рН-метр 728 рН lab, Metrohm AG, Швейцария; центрифуга Eppendorf 5415D, Германия; встряхиватель типа вортекс ELMI, Латвия; концентратор Eppendorf Concentrator plus, Германия; дозаторы переменного объема Ленпипет 10 – 100 мкл и 100 – 1000 мкл,Россия; холодильник Indesit, SD 125, Россия; морозильник для плазмы Sanyo, Япония; система водоподготовки Millipore, Milli-Q Advantage A10, Франция; микропробирки Eppendorf 1,5 мл; колбы мерные класса «А» вместимостью 20, 50 и 100 мл; пипетки аналитические класса «AS» вместимостью 5, 10 мл.Реактивы ацетонитрил Super Gradient, Lab-Scan Analytical Sciences; муравьиная кислота (х.ч.); вода очищенная; вода Milli-Q; метанол (Scharlau, Испания, класс «для ВЭЖХ»).332.2 Стандартный образец и объекты исследованияСтандартный образец тиозонид цитрат, субстанция-порошок (предоставлен ЗАО «Фарм-Синтез»,серия 09112012, годен до 11.2014, чистота более 99 %, Россия).Объекты исследованияДля изучения фармакокинетики препарата тиозонид в качестве объектовисследованияиспользовалиобразцыплазмыкровипослеоднократногоперорального приема препарата здоровыми добровольцами в дозе 25 мг, 200 мг,400 мг и 600 мг.2.3 Дизайн фармакокинетического исследованияПроводилиодноцентровоепроспективноенерандомизированноеисследование с последовательным включением добровольцев с эскалацией дозыдля оценки безопасности, переносимости и изучения фармакокинетическогопрофиля препарата, впервые применяющегося у человека.

Характеристики

Список файлов диссертации