Диссертация (1141252), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Неадекватное разбавлениеможет привести к недостаточной чувствительности, а ввод в хроматографическуюколонку сильнокислой пробы или пробы с существенно большим содержаниемацетонитрила или метанола, чем в подвижной фазе (зачастую осаждающийреагент входит в состав подвижной фазы), может сопровождаться изменениемпараметров пригодности хроматографической системы (времени удерживаниякомпонентов, симметрии пиков, снижении эффективности (числа теоретическихтарелок) и др.).40После процедуры осаждения белков их отделяют от надосадочной жидкостицентрифугированием, далее хроматографируют.Опробовали различные осаждающие реагенты (метанол, ацетонитрил,трихлоруксусная кислота) и соотношения объемов плазмы и осаждающегореагента.
Использование ацетонитрила позволило достичь максимальной степениосаждения при использовании минимальных затрат осаждающего реагента. Такимобразом, в качестве осаждающего реагента был выбран – ацетонитрил всоотношении (1:1).ПробоподготовкаВ микропробирки Eppendorf 1,5 мл помещали 500 мкл плазмы крови, затемприбавляли 500 мкл ацетонитрила, встряхивали на вихревой мешалке в течение 12 мин, центрифугировали при 13200 оборотов в минуту (об/мин) в течение 10минут и отделяли надосадочную жидкость. Полученную надосадочную жидкостьпереливали из в виалы на 2,0 мл и помещали в автосэмплер хроматографа.Образцы чистой и исследуемой плазмы крови хранили в морозильнике притемпературе от минус 75 до минус 80 оС.Приготовление стандартных растворов тиозонидаДля приготовления исходного стандартного раствора тиозонида точнуюнавеску стандартного образца тиозонида (0,001 г) помещали в мерную колбувместимостью 100 мл, добавляли 3 мл метанола до полного растворения, а затемдоводили объем раствора водой Milli-Q до метки и перемешивали.
В полученномрастворе концентрация тиозонида составляла 10 мкг/мл. Рабочие стандартныерастворы готовили в мерных колбах разведением исходного стандартногораствора тиозонида водой Milli-Q (Таблица 1). Стандартные растворы хранили вхолодильнике при температуре от 2 до 8 оС.41Таблица 1АликвотаДоводилиобъем раствораводой Milli-Qдо, млПолученнаяконцентрация рабочегостандартного раствора,нг/мл10 мл исходного стандартного 100растворатиозонидасконцентрацией 10 мкг/мл1000 (раствор 1)5 мл исходного стандартного 100растворатиозонидасконцентрацией 10 мкг/мл500 (раствор 2)10 мл раствора 220250 (раствор 3)10 мл раствора 250100 (раствор 4)5 мл раствора 110050 (раствор 5)10 мл раствора 52025 (раствор 6)10 мл раствора 410010 (раствор 7)10 мл раствора 51005 (раствор 8)10 мл раствора 8501 (раствор 9)Стандартные растворы хранили в холодильнике при температуре от 2 до 8оС.3.2 Разработка методики определения тиозонида в плазме кровиКоличественноеопределениепроводилинавысокоэффективномжидкостном хроматографе Agilent 1200 с масс-спектрометрическим детектором42MS 6120, Agilent Technologies, США.
Выбор метода ВЭЖХ с массспектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС) для количественного определениятиозонида в плазме крови обусловлен рядом существенных преимуществ данногометода: возможность анализа широкого спектра соединений даже в минорныхконцентрациях,чтопозволяетпроводитьдетектированиесвысокойчувствительностью и селективностью; малый объем биоматериала, требуемыйдля анализа.Подбор условий хроматографического разделенияПодвижная фазаРастворители, применяемые в ВЭЖХ, должны удовлетворять следующимосновным требованиям: чистота, химическая инертность, совместимость сдетектором,достаточнаярастворяющаяспособностьпоотношениюканализируемым веществам, низкая вязкость, безопасность, доступность [75].Растворитель активно участвует в самом процессе разделения. При выборерастворителей необходимо учитывать весь комплекс их свойств, в той или инойстепени влияющих на проведение хроматографического эксперимента.
Вбольшинстве случаев используют смесь растворителей, что резко расширяетвозможности хроматографической системы (дает возможность оптимизироватьпроцесс, улучшить форму пиков и эффективность разделения).В ходе исследования опробовали смеси растворителей: метанол-вода всоотношении 80:20, при этом наблюдалось слишком быстрое элюированиекомпонента. Затем перешли к соотношениям 60:40, 40:60, однако достаточнохорошего элюирования с приемлемым временем удерживания достигнуть так и неудалось.
Далее опробовали ацетонитрил в тех же соотношениях, параллельноподбирая реагент для регулирования рН.рН подвижной фазы также является важным фактором при анализе, так какон может изменить гидрофобный характер анализируемого вещества [75]. Длясоздания оптимального значения рН многие методы используют буферный агент.В качестве буферного агента чаще всего используют фосфатные буферныерастворы, однако в случае ВЭЖХ-МС использование фосфатных буферных43растворов не допустимо, так как они нелетучи и осаждаются в ионизационнойкамере детектора. При работе с масс-спектрометрическим детектором можноиспользоватьлетучиеорганическиекислоты(муравьиная,уксусная,трифторуксусная кислоты), ацетатно-аммонийный, формиатно-аммонийный илитрифторацетатно-аммонийный буферные растворы.Тиозонидоснованием,являетсяпоэтомуподлясвоейхимическойдостиженияструктурелучшейорганическимчувствительностипредположительный диапазон значений pH - 2-4.
В ходе эксперимента в качествеподвижной фазы опробовали уксусную, муравьиную и трифторуксусную кислотыдля диапазона рН 2-3,5. По результатам эксперимента наиболее подходящейфазой является 0,1 % раствор муравьиной кислоты. При использованиимуравьиной кислоты удалось снизить предел обнаружения, добиться лучшейионизации.Таким образом, для анализа тиозонида в качестве подвижной фазы намибыла выбрана смесь растворителей 0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде /ацетонитрилвсоотношении40:60,чтопозволилодостичьнаиболеесимметричных и узких пиков.Неподвижная фазаВыбор условий масс-селективного детектирования осуществлялся в режимепрямого ввода образца в масс-детектор без использования разделяющей колонки,а также с использованием колонки с привитыми алкильными радикалами ( -С8, С18). Было установлено, что определение тиозонида может быть произведено налюбой из исследованных неподвижных фаз, однако наилучшие результатыдостигнуты при использовании колонки Agilent Eclipce XDB-C18, 4.6x50 мм; 1,8мкм.Использование короткой колонки позволило сократить общее времяхроматографирования до 4 мин.ДетектированиеПри выборе условий опробовали как электрораспылительный вариант(Electrospray Ionization, ESI), так и вариант химической ионизации при44атмосферном давлении (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI).Исследовали возможность регистрации положительных и отрицательных ионов.ESI происходит при взаимодействии сильного электростатического поля(напряжение примерно 3-5 кВ) с поверхностью жидкости на конце капиллярнойтрубки.
В исследуемой жидкости должны быть ионы, для этого обычнодобавляют небольшие количества солей, кислот или другие соединения, которыеспособныпривестикобразованиюионов[76,Элюент77].изхроматографической колонки под воздействием поля распыляется с образованиеммелких заряженных капель. Лучшей ионизации способствовало добавление вподвижнуюфазухроматографическойсистемынебольшогоколичествамуравьиной кислоты (~ 0,1 %). Процесс распыления происходит при атмосферномдавлении и усиливается при добавлении газа в ионизационную камеру (азотавысокой чистоты (99,999 %)). Азот способствует испарению растворителя изкапель. Капли уменьшаются, плотность поверхностного заряда увеличивается,что приводит к образованию капель меньшего размера. В конечном итогепроисходит выделение ионов из ионных кластеров, которые поступают в массанализатор.ESI относится к «мягким» методам ионизации [76, 78].
В качестве ионов(наряду с фрагментами) исследуемой молекулы образуются протонированный илидепротонированный ионы, наличие которых характеризует соответственноположительную или отрицательную моды масс-спектрографии. Отрицательнаямода менее чувствительна, за исключением тех случаев, когда происходитобразование стабильных анионов, например, карбоксильных групп.В результате экспериментов установлено, что наилучшее соотношениесигнал/шумдлятиозонидадостигаетсяприиспользованииэлектрораспылительной ионизации при регистрации положительных ионов.Время удерживания тиозонида составило около 2,0 мин.Таким образом, резюмируя все вышесказанное, для анализа тиозонида былиподобраны следующие условия хроматографирования:45подвижная фаза: 0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде/ацетонитрил (40:60),предварительно дегазированнаяскорость потока подвижной фазы: 1,1 мл/миннеподвижная фаза: хроматографическая колонка Agilent Eclipce XDB-C18 4.6x50мм; 1,8 мкм, при температуре 30 оСобъем вводимой пробы: 10 мклвремя удерживания: около 2,0 +- 0,04 миндетектирование: масс-спектрометрический детектор, тип ионизации: ESI; режимсканирования: режим индивидуальных масс (SIM) по положительному иону m/z= 561,1 (тиозонид); высушивающий газ – азот: скорость потока и температураосушающего газа 12 л/мин и 250°С, соответственно; напряжение на капилляре4000 В, напряжение на фрагменторе 70 Вобщее время хроматографирования: 4 мин.3.3 Валидация методики определения тиозонида в плазме кровиВалидацию методики проводили, ориентируясь на требования «Руководствапо экспертизе лекарственных средств» под редакцией профессора А.Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
