Диссертация (1141252), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Так, площадь под фармакокинетической кривой (отнуля до последней точки забора крови) для препарата Азитромицин составляла –1,84+0,4 мкг ч/мл, а для препарата Сумамед – 1,94+0,49 мкг ч/мл. Остальныепараметры фармакокинетики также были близкими. Статистический анализпараметровфармакокинетикипоказалбиоэквивалентностьпрепаратовАзитромицин и Сумамед® [98].Примером применения ВЭЖХ-МС в исследованиях биоэквивалентноститакже может служить работа коллектива авторов [99], где в рамках перекрёстного,открытого, рандомизированного исследования с недельным периодом отмывки, сдвумяпоследовательностямибылаизученабиоэквивалентностьдвухтаблетированных форм ондансетрона на 18 добровольцах (дозировка 8 мг).Образцы плазмы крови анализировали валидированным методом ВЭЖХ-МС, свнутренним стандартом — трописетроном.91Для анализа использовалась колонка XDB-С18 5 мкм 4,6×150 мм; в качествеподвижной фазы использовали - раствор 0,05% муравьиной кислоты иацетонитрил(25:75);ионизацияэлектрораспылением,регистрацияположительных ионов, целевой ион ондансетрона с m/z =294,15±0,1 итрописетрона с m/z =285,15±0,1.
Предел количественного определения составил 1нг/мл.Дляанализируемыхфармакокинетическиепрепаратовпараметры:былизначениярассчитаныплощадиподосновныекривыми«концентрация-время» (AUC0-t); максимальная концентрация в плазме и время еёдостижения, общая площадь под кривой AUC0-∞, период полувыведения,соотношение AUC0-t и AUC0-∞, показатель скорости всасывания, константаэлиминации. По результатам исследования сделан вывод о биоэквивалентностисравниваемых препаратов ондансетрона.Широкие возможности метода ВЭЖХ-МС также позволяют определятьсразу несколько соединений в биоматериале. В качестве примера в статьеколлектива авторов [100] проведено определение одновременно четырехпрепаратов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с массспектрометрическим детектированием, ионизация электрораспылением (ВЭЖХ–МС/ESI).
Анализировали четыре наиболее часто назначаемых лекарственныхсредства при лечении депрессии: флуоксетин, циталопрам, пароксетин ивенлафаксин в плазме крови человека. Пробоподготовку проводили методомтвердофазнойэкстракцииспоследующимподщелачиванием.Пределыобнаружения для флуоксетина, циталопрама, пароксетина и венлафаксинасоставили 0,5, 0,3, 0,3 и 0,1 нг / мл, соответственно.
Исследуемые вещества былиидентифицированы в виде аддуктов Н+ - флуоксетин, m/z = +, 310.1; циталопрам,m/z = +, 325.1; пароксетин, m/z = +, 330.1; венлафаксин, , m/z = +, 278.1. Ранеепроводились исследования некоторых из этих препаратов методами ВЭЖХ с УФдетектированием [101], ГЖХ [102]. Тем не менее, не один из этих методов необеспечивал быстрой одновременной количественной оценки и идентификацииданных препаратов.92Безусловно, метод ВЭЖХ с УФ детектированием также является одним изнаиболее распространенных и широко используемых при анализе ЛС, чтообъясняется достаточно высокой чувствительностью, простотой, доступностью сэкономической точки зрения [103]. Однако, УФ-детектор является менеечувствительным,чеммасс-спектрометрический,чтоограничиваетегоиспользование при определении минорных концентраций лекарственных средствв сложной многокомпонентной матрице.Так, например, в литературе имеются данные фармакокинетичсекихисследований инновационного противотуберкулезного препарата перхлозонметодами ВЭЖХ с УФ детектором и ВЭЖХ с масс-спектрометрическимдетектором [104].
Полученные результаты исследований свидетельствовали отом, что последний является наиболее чувствительным.В обоих исследованиях подготовку проб проводили методом осаждениябелков. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическаяколонка Agilent «Z ORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» c предколонкой «ZORBAXSB C18 5мкм, 35*2,1мм». В качестве подвижной фазы использовали смесьацетонитрила и 0,1% раствора трифторуксусной кислоты (рН=2,6) в соотношении85:15. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Для детектирования использовалиспектрофотометрический (длина волны - 317 нм) и масс-спектрометрическийдетекторы.
В случае последнего ионизацию проводили с помощью электроспреяпри атмосферном давлении, детектирование проводили в SIM режиме помолекулярному иону 183,4 m/z. Время удерживания перхлозона в указанныхусловиях — 3,05 мин.Аналитический диапазон методики для УФ-детектирования составил 25010000 нг/мл, в то время как для масс-спектрометрического детектирования -1010000 нг/мл. Таким образом, определение перхлозона с использованиемспектрофотометрического детектирования являлось возможным, в виду высокихконцентраций препарата в крови, однако, данная методика не позволялапроводить определение концентрации перхлозона в плазме крови пациентов нафоне сопутствующей противотуберкулезной терапии.93На основании полученных данных была разработана и валидирована новаяметодика определения перхлозона в плазме крови человека, которая нашлапрактическое применение как для фармакокинетических исследований, так и длятерапевтическогомониторингаПробоподготовкупроводилитрифторуксуснойкислоты.нафонеосаждениемБылисопутствующейбелковподобраныплазмытерапии.спомощьюследующиеусловияхроматографирования: неподвижная фаза – Колонка ZORBAX Eclipse Plus C18150 x 4,6 мм 5 мкм, предколонка ZORBAX Eclipse Plus C18 12,5 x 4,6 мм 5 мкм,температура колонки 25 оС; подвижная фаза - 50 мМ фосфатный буфер с 5 мМоктансульфонатом натрия рН 2,50 – ацетонитрил (85:15); скорость потока - 1мл/мин; объем вводимой пробы - 50 мкл; детектирование - длина волны 347±4 нмс записью спектра в диапазоне 220-400 нм; время удерживания 5 – 6 мин.
Пределколичественного определения методики составил 200-20000 нг/мл [104].Методикапоказаладостаточнуючувствительность,правильностьивоспроизводимость, однако достичь такой же высокой чувствительности как прианализе методом ВЭЖХ-МС так и не удалось, что ограничивает совместноеопределение перхлозона совокупно с другими препаратами, когда в связи сбольшим количеством мешающих соединений возможно падение уровняконцентраций перхлозона в плазме крови ниже терапевтического. Этот фактприобретает особую важность с учетом того, что немалый % составляет долябольныхтуберкулезом,ассоциированнымсоспектромсопутствующихзаболеваний.Еще один пример сравнения ультрафиолетовой (УФ) и масс-детекциипредставлен в [105].
Проводили анализ содержания в плазме крови крыспотенциального лекарственного вещества с помощью УФ и масс-детектирования.Существенно, что невысокая чувствительность определения концентрациивещества при УФ детектировании, приводит к недопустимому искажениюзначений таких важных для высокопроизводительного фармакокинетическогоскрининга параметров, как период полувыведения (T1/2) и площадь подфармакокинетической кривой (AUC), таким образом, при УФ детектировании -94T1/2=1,63 ч, AUC=648 нг/мл*ч, предел количественного определения методикисоставил 100 нг/мл; при МС детектировании - T1/2 =4,53 ч, AUC=1091 нг/мл*ч,предел количественного определения методики составил 10 нг/мл.Таким образом, несмотря на то, что основным недостатком метода ВЭЖХМС является достаточно высокая стоимость оборудования, хромато-массспектрометрия является мощным аналитическим инструментом в исследованияхлекарственных средств. Такое преобладание существенных достоинств, каквысокаяпроизводительностьичувствительность,универсальность,экспрессность, толерантность к присутствию примесей, а также возможностьбыстрого перехода от одной методики к другой без сложных предварительныхдействий, что особенно важно, если речь идет об инновационной молекуле,позволяет компенсировать этот недостаток.Применениетогоилииногометодаанализаприоценкефармакокинетических свойств лекарственных средств в каждом конкретномслучае определяется структурой исследуемого соединения и оснащенностьюлаборатории.Такимобразом,электрораспылительнымнамивариантомбылвыбранионизации,методВЭЖХ-МСкоторыйпозволилсповозможности упростить и ускорить процедуру анализа.Выбранныйаналитическийметоддолженпозволятьотделятьанализируемое вещество от других компонентов образца.
Однако при наличиидаже самой современной аналитической аппаратуры невозможно достичьдостаточно достоверного отделения аналита без грамотного выбора процедурыпробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологических матриц.Основными сопутствующими веществами, мешающими проведению анализаметодом ВЭЖХ с любым видом детектирования, являются белки (такжеприсутствуют липиды, биогенные амины, клеточные структуры, некачественноотделенные форменные элементы и пр.) [49, 105]. Как упоминалось в Главе 3, припроведении исследований методом ВЭЖХ выделяют три основных способаподготовкипробканализу:концентрирование (ТФЭ).осаждениебелков,ЖЖЭисорбционное95Метод осаждения белков является наиболее простым, быстрым, недорогимв исполнении, однако не всегда способен обеспечить достаточную степеньочистки аналита.
Основная задача при использовании данного метода - подобратьосаждающий реактив, необходимый для обеспечения достаточной эффективностиосаждения белков из плазмы. Недостаточная эффективность осаждения – являетсяосновным фактором, ограничивающим использование процедуры осаждениябелков при разработке методик определения лекарственных средств, что связано ссоосаждением аналита с белками плазмы крови и сложностью биологическойматрицы. Эффекты влияния остаточных компонентов после осаждения белков(матричные эффекты) выявлены в ряде масс-спектрометрических исследований.Главным образом наблюдается подавление сигнала аналита, приводящее кнедостаточнойчувствительностиинесоответствиюзначенийтакихвалидационных параметров, как повторяемость и правильность [106].Процедура ЖЖЭ гораздо более селективна в сравнении с осаждениембелков и позволяет достигать высоких степеней извлечения [67, 107], однакопроцесс проведения является достаточно трудоемким и времязатратным,включаетдовольнобольшое количествоманипуляцийс образцом, чтоограничивает использование данного метода.Метод ТФЭ основан на специфических взаимодействиях выделяемогосоединения (или мешающих компонентов матрицы) с сорбентом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
