Диссертация (1141252), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

ТФЭ позволяетполучать высокоочищенные пробы, содержащие малое количество постороннихвеществ.ДляТФЭхарактерныболееширокиевозможноститиповвзаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостнойэкстракции,чтообеспечиваетнаиболееселективноеиколичественноеконцентрирование и/или извлечения аналитов (ионообменные механизмы,сродство к органической фазе). По трудоемкости ТФЭ сопоставима с ЖЖЭ, ачасто сопровождается большим количеством этапов пробоподготовки, чем ЖЖЭ.Для анализа тиозонида применим любой из перечисленных методов. Сучетом всех факторов, таких как надежность и точность, простота эксплуатации,время,необходимоедлявыполненияпроцедурывкачествеметода96пробоподготовки был выбран метод осаждения белков, как весьма быстрый ипростой.

Данный способ обеспечивал достаточную чистоту исследуемогокомпонента для проведения анализа выбранным нами методом.Разработаннаяследующимбиоаналитическаяосновнымметодикахарактеристикам:былавалидированаселективность,полинейность,правильность (на уровнях inter-day и intra-day), прецизионность (на уровнях interday и intra-day), предел количественного определения, стабильность растворов,перенос пробы.Селективность определения была подтверждена использованием 6 образцовчистой плазмы, образца чистой плазмы с прибавлением стандартного растворатиозонида в диапазоне концентраций 1нг/мл – 1000 нг/мл.

Методика былапризнана селективной, поскольку на хроматограммах образцов чистой плазмы ненаблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времениудерживания тиозонида.Отклик прибора на концентрацию определяемого вещества должен бытьизвестен и оценен в определенном концентрационном диапазоне. Исходя изполученныхданныхдоклиническихисследованийтиозонида,дизайнклинического исследования предполагал достаточно широкий интервал дозпрепарата (25-600 мг) в широком временном интервале (0-168 ч). В связи с этимстояла задача выбрать достаточно широкий концентрационный диапазон, чтобыобеспечить адекватное описание фармакокинетики определяемого вещества.Линейность методики была подтверждена путем анализа 9 образцов чистойплазмы с прибавлением раствора стандартного образца тиозонида до полученияконцентраций: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл,500 нг/мл и 1000 нг/мл.

По полученным значениям был построен калибровочныйграфик зависимости площади пика тиозонида от его концентрации в плазме (r2>0,998) совместно с уравнением калибровочной кривой. Полученные отклоненияконцентраций калибровочных растворов тиозонида от фактических значенийсоответствовали нормам (не более 20 % для нижнего диапазона линейности, неболее 15 % - для остальных точек). Таким образом, разработанная методика была97признана линейной в пределах от 1 нг/мл до 1000 нг/мл. Как видно из данныхпредыдущей главы, Сmax тиозонида составила 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ±131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг,соответственно, поэтому данный диапазон концентраций обеспечивал адекватноеописание фармакокинетики определяемого вещества.Правильность и прецизионность аналитической методики оценивалисьпутем анализа четырех образцов чистой плазмы с прибавлением стандартногораствора тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл,1000 нг/мл, каждый из которых хроматографировали по 5 раз.

Исследованиепроводили в течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter-day). Полученныевеличины RSD (%) и ε (%) соответствовали нормам FDA и EMA (не более 20 %для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальных концентраций),что позволило считать методику точной и прецизионной.В литературе имеется немало примеров, где оценку правильности ипрецизионности проводят путем анализа трех образцов. Так в [100] правильностьи прецизионность также были доказаны внутри аналитического цикла и междуаналитическим циклами, однако с использованием трех образцов чистой плазмы сприбавлением стандартных растворов флуоксетина, циталопрама, пароксетина ивенлафаксина соответственно до получения концентраций 10, 70 и 400 нг/мл.Каждый раствор хроматографировали по 5 раз, величины RSD (%) и ε (%)соответствовали нормам FDA и EMA (не более 20 % для минимальнойконцентрации, не более 15 % - для остальных концентраций).

Это допустимо,посколькусогласнотребованиямFDAприоценкеправильностиипрецизионности методики рекомендуется анализировать не менее трех уровнейконцентраций, в то время как драфт-руководство ЕМА имеет более высокиетребования к определению правильности и прецизионности и рекомендуетанализировать не менее четырех уровней концентраций [79, 80].В Руководстве ЕМА указано, что прецизионность и правильность должныопределяться как минимум на четырех уровнях концентрации: для ПКО, дляточки, в 3 раза большей ПКО, около 50% от диапазона калибровочной кривой и98около 75% от максимального значения на калибровочной кривой. Регламентируяопределение данных характеристик при концентрации, равной ПКО, данная схемагарантируетвысокоекачествоколичественногоанализапринизкихконцентрациях, например в случае изучения кинетики выведения лекарственногопрепарата.

Принимая во внимание всё вышесказанное, а также с учетом широкогоаналитического диапазона концентраций тиозонида в плазме крови было приняторешение проводить анализ прецизионности и правильности на 4 стандартныхрастворах.На основании данных линейности, правильности и прецизионности былопределен ПКО методики. Минимальное значение концентрации тиозонида вплазме, для которой возможно определение тиозонида со значениями RSD и ε неболее 20 % в диапазоне линейной зависимости составило 1 нг/мл, что адекватносоотноситься с ожидаемым нижним уровнем концентраций лекарственногопрепарата в реальных образцах клинического исследования.

Как видно изпоученных результатов, достигнутое значение ПКО на уровне 1 нг/мл позволилоопределить следовые концентрации тиозонида уже через 30 мин после приемапрепарата в дозировке 25 мг (Cmin тиозонида после приема препарата в дозировке25 мг составляет 1,1 нг/мл). Как отмечалось выше, метод ВЭЖХ-МС обладаетвысокой чувствительностью. Так в [100] предел обнаружения составил 0,5 нг/млдля флуоксетина, 0,3 нг/мл для циталопрама, 0,3 нг/мл для пароксетина и 0,1нг/мл для венлафаксина, соответственно.

Для перхлозона чувствительностьметодики для масс-спектрометрического детектирования составила 10 нг/мл[104].Таким образом, было доказано, что разработанная методика являетсяселективной, точной, прецизионной и линейной в диапазоне концентрацийтиозонида от 1 нг/мл до 1000 нг/мл, соответствует по всем параметрамтребованиям руководств FDA [79] и EMA [80] по валидации биоаналитическихметодик.Туберкулез является сложным инфекционным заболеванием.

Лечениебольныхтуберкулёзомдлительное(6-18месяцев)ивключает99многокомпонентнуютерапию,котораязачастуюнасчитываетдесяткиантибактериальных препаратов. Резюмируя данные Главы 1, это связано главнымобразом с тем, что сегодня можно выделить три основные составляющиераспространенности туберкулезной инфекции. Первая составляющая - этовозрастание заболеваемости типичным туберкулезом; вторая составляющаяобусловлена химиорезистентным туберкулезом, который распространяется оченьбыстрыми темпами и создает большую опасность; третья составляющая — этотуберкулез на фоне СПИДа и у ВИЧ-инфицированных больных. Кроме тогопроводят комплекс неспецифических мероприятий, направленных на укреплениезащитных сил организма (витаминотерапию, лечебное питание и др.).

Поэтомуцель данного исследования заключалась в разработке и валидации такойметодики определения тиозонида в плазме крови человека, которая могла бы бытьприменима как для фармакокинетических исследований, так и в дальнейшем длятерапевтического мониторинга на фоне сопутствующей терапии.Разработанная методика количественного определения тиозонида в плазмекрови имеет реальную практическую значимость, так как в достаточной степенирешает весь спектр аналитических задач, связанных с данным объектомисследования.Разработанная нами методика была успешно применена в рамках I фазыклинического исследования по изучению фармакокинетики препарата Тиозонид.Исследование проводилось с участием 40 здоровых добровольцев (здоровыедобровольцы мужского пола от 18 до 45 лет включительно), которые былиразделены на 4 группы (когорты), при однократном приеме возрастающих дозпрепарата: 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг.

Включение добровольцев по 10 человеквкогортуспоследовательнымфармакокинетическиесвойстваповышениемпрепаратадлядозыпозволилопроведенияописатьклиническихисследований II и III фазы.Оценка ФК проводилась по концентрации тиозонида в плазме каждогодобровольца, получавшего исследуемый препарат.100Индивидуальные профили изменения концентpаций тиозонида в плазмекровивовремени,зарегистрированныепослепроведенияклиническогоисследования количественно оценивали определив максимальную концентрациюлекарственного вещества (Cmax) и время ее достижения (Tmax), площадь подкривой «концентрация – время» в пределах от нуля до момента отбора последнейпробы крови (AUC0-168), рассчитанной методом трапеций, общую площадь подфармакокинетической кривой (AUC0-∞) и соотношением Cmax к AUC0-168.Дополнительно определяли константу элиминации (kel), период полувыведения(T1/2), среднее время удерживания (MRT) , отношение значений AUC0-168 с общимAUC0-∞ (AUC0-168 / AUC0-).При поступлении в системный кровоток Тиозонид постепенно всасывался(среднее значение Tmax около 6 часов), его концентрация постепенно возрастала,достигая значений Сmax 70 ± 8 нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193нг/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и 600 мг, соответственно, а затемначинала снижаться.AUC0-168 тиозонида составила 1267 ± 265 нг*ч/мл; 10508 ± 2108 нг*ч/мл;16760 ± 1713 нг*ч/мл; 25231 ± 1862 нг*ч/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и600 мг, соответственно.В ходе исследования на основе полученных данных была показаналинейность фармакокинетики препарата в интервале доз 25-600 мг по Сmax иAUC0-168 (R2 > 0,99).

Увеличение вводимой дозы пропорционально влияло наувеличениеконцентрациитиозонидавплазмекровииплощадиподфармакокинетической кривой.При пероральном приеме препарата среднее значение времени достижениямаксимальной концентрации ЛВ (Tmax) для дозировки 25 мг составило около 5часов, для дозировок 200 мг, 400 мг и 600 мг среднее значение T max составилооколо 6 ч. Период полувыведения для дозировок 25 мг , 400 мг и 600 мг составил24 часа, для дозировки 200 мг – 26 часов, что показывает медленное выведениепрепарата из плазмы крови.

Скорость процесса элиминации препаратахарактеризовалась константой элиминации (kel), для расчета которой принимали101во внимание весь нисходящий участок фармакокинетической кривой сненулевыми значениями концентраций. Тиозонид практически не обнаруживалсяв плазме крови спустя 168 ч после однократного применения для всегоанализируемого диапазона дозировок, либо обнаруживался на очень низкихуровнях для дозировок 200-600 мг.Былодоказано,исследованиячтовыбранныйобеспечиваетфармакокинетическихрегламентнеобходимуюпараметровтиозонида,фармакокинетическогонадежностьочемоценкисвидетельствуютрассчитанные данные соотношений значения площади под кривой «концентрация– время» в пределах от нуля до момента отбора последней пробы крови (AUC0-168)со значением общей площади под фармакокинетической кривой (AUC0-∞)..Отношение AUC0-168/AUC0-∞ составляло значительно больше 80% для каждойанализируемой дозировки: для дозировки 25 мг усредненное значение отношенияAUC0-168/ AUC0-∞ составило 100%, для дозировки 200 мг – 95%, для дозировки 400мг – 100%, для дозировки 600 мг – 99 %.Первая фаза клинических исследований – это связующее звено междунаучнымиисследованиямифармакокинетическогоиклиническойисследованияпрактикойиспользуютсяв[108].Результатыобоснованиисхемдозирования разрабатываемых лекарственных средств, которые в последующемуточняются в клинических исследованиях.Таким образом, на основе представленных данных и всего вышесказанного,можно сделать вывод о том, что в рамках диссертационной работы поставленныезадачи выполнены и цель достигнута.102ОБЩИЕ ВЫВОДЫ1.

Характеристики

Список файлов диссертации