Диссертация (1141097), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Далее стекла остывали около 20 минутпри комнатной температуре. Для блокировки эндогенной пероксидазы, остывшиестекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) иинкубировали 15 минут с 3 % раствором Н2О2. После обработки перекисьюпредметныестеклаополаскиваливфосфатномбуфере(рН 7,0-7,6)иинкубировали с Ultra-V-Block (LabVision, USA) во влажных камерах в течение30 минут для блокирования неспецифических белковых взаимодействий. Поокончании инкубации излишки реагента аккуратно стряхивали со стекол инаносили первичные антитела.
В качестве первичных антител использовали37антитела к ER (клон 1D5, RTU, DAKO, США, 1:35); антитела к PR (клон 636,RTU, DAKO, США, 1:50); антитела к LIF (polyclonal rabbit Ab, Sigma, 1:1000);антитела к HOXA 10 (polyclonal rabbit Ab, GeneTex, 1:100), антитела кпротоонкогену bcl-2 (клон 124, Cell Marque, 1:100).Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 минут до 1 часа, взависимости от времени воздействия, предусмотренного фирмой производителем,указанном в спецификации к антителу. После завершения инкубации срезытщательно отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6) от первичных антител, несвязавшихся с эпитопами, затем наносили вторичные антитела. Время инкубациис вторичными антителами во влажных камерах составляло 30 минут.
Поокончании инкубации срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6). Дляметки вторичных антител использовали авидин-биотиновый комплекс (АВК KIT,DAKO). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовалиметку – фермент, пероксидазу хрена, в присутствии субстрата – перекисиводорода – и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином (LSAB,Dako Cytomation). В результате образовывался нерастворимый в органическихрастворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в видекоричневого окрашивания структур клеток и экстрацеллюлярного матрикса.Срезы инкубировали с диаминобензидином от 5 до 15 минут, в зависимости отинтенсивности окрашивания.
Далее стекла ополаскивали в дистилированной водеи подкрашивали ядра гематоксилином в течение 2-3 минут. Затем стекладегидратировали в ряде, состоящем из дистилированной воды, 70 % спирта,80 % спирта, двух 95 % спиртов, двух абсолютных спиртов и трех ксилолов.Послечегосрезыпокрывалипокровнымистекламисиспользованиемставилиположительныесинтетической среды.Дляиммуногистохимическихреакцийиотрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцыисследуемыхсрезов,которыеподвергалисьстандартнойпроцедуреиммуногистохимии, но без добавления первичных антител.
Положительные38контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями отфирмы производителя.Проводили полуколичественную и количественную оценку результатовреакций.Результатыиммуногистохимическойреакцииоценивалиполуколичественным методом в баллах по количеству позитивно окрашенныхклеток. Оценку интенсивности реакции проводили по 6-ти бальной системе:2 балла – до 20 % окрашенных клеток; 4 балла – от 20 до 40 % окрашенныхклеток; 6 баллов – более 40 % окрашенных клеток.
Оценку экспрессии ER и PRпроводили с использованием метода гистологического счета HISTO Score поформуле: (2.2):HS=3а+2b+1с ,(2.2)где числа от 1 до 3 отражают интенсивность окрашивания, выраженную в баллах;а, b, с – соответственно доли интенсивно, умеренно и слабо окрашенных клеток,выраженные в процентах.Степень выраженности экспрессии ER и PR оценивали в процентах: 0-10 %– отсутствие экспрессии, 11-100 % – слабая экспрессия, 101-200 % – умереннаяэкспрессия, 201-300 % – выраженная экспрессия.Рассматривали также коэффициент PR / ER, рассчитанный по строме.Основным прогностически благоприятным критерием наступления беременностиявляется соотношение PR / ER в диапазоне от 2 до 5 [27].Для оценки рецептивности также проводили ИГХ исследование экспрессиигенов HOXA 10 (polyclonal rabbit Ab, «GeneTex»; разведение 1:100), ПОГ bcl-2(клон 124, «Cell Marque»; разведение 1:100) и экспрессии LIF в эндометрии(polyclonal rabbit Ab, «Sigma»; разведение 1:1000) и цервикальной слизи (ИФАнабор тест-системы «Human Leukemia inhibitory factor (LIF) ELISA kit», CusabioBiotech, catalog № CSB-E04651h), забираемой при помощи урогенитального зонда(«Jingsu Suyun Medical Materials Co LTD», Китай) до взятия аспирата из полостиматки.39У всех женщин, включенных в исследование, оценивался характербиоценозаокрашенныхвлагалищапопутемГраму.Примикроскопическогоналичиипоказанийисследованияотдельномазковвыполняликультуральное и иммунологическое исследование на наличие инфекцийпредающихся половым путем.
Всем больным, проводили цитологическоеисследование мазков-отпечатков эпителия влагалищной части шейки матки.Всем пациенткам, не подвергавшимся хирургическому лечению, былвыполнен следующий спектр лабораторных исследований: клинический анализкрови, исследование биохимических параметров крови, отражающих функциюпечени, почек углеводного и липидного обмена, параметров состояниясвертывающей системы крови.Всем пациенткам, готовящимся к операции помимо такого же перечняанализов, было проведено определение групповой принадлежности крови и резусфактора, иммунологический скрининг для исключения сифилиса, вирусаиммунодефицита человека, вирусного гепатита В и С.Состояние сердечнососудистой и дыхательной систем оценивали порезультатам электрокардиограммы в 12 отведениях и рентгенологическогоисследования органов грудной клетки.
Пациентки перед оперативным лечениемпроходиликонсультациютерапевтомианестезиологом,попоказаниямосуществлялись консультации других специалистов.Гистологическое и цитологическое исследование слизистой оболочки тела ишейки матки в предоперационном периоде, а также тканей, удаленных приоперативном вмешательстве, проводилось по стандартным методикам.402.4Хирургическая тактика ведения пациентовНа предоперационном этапе проводилось информирование пациенток опредстоящихмедицинскихпослеоперационногоинформированноепериода.согласиепроцедурах,ходеПациенткинаоперации,подписывалипроведениетечениидобровольноеоперации,оказаниеанестезиологического пособия, а после операции, получали на руки подробноеописание техники выполнения перевязок, порядка приема лекарств, переченьразрешенных продуктов.Лапароскопическиевмешательствавыполнялисиспользованиемлапароскопического оборудования фирм «Karl Storz» (Германия), «Covidien»(США),«Olympus»(Япония)постандартнойметодике,сналожениемпневмоперитонеума углекислым газом с помощью инсуфлятора Endoflator («KarlStorz», Германия) через иглу Veresh.
Внутрибрюшное давление на этапеинсталляции составляло 12-13 мм рт.ст., на хирургическом этапе могло бытьснижено до 8-10 мм рт.ст. В последующем вводили три троакара диаметром11 мм («Karl Storz», Германия; «Covidien», США): с гладкой канюлей вумбиликальной области для оптики и с винтовой нарезкой в гипогастрии дляинструментов.Во время операции пациентка должна располагаться на спине влитотомической позиции, таким образом, что бы ягодицы в нижней трети неполностью опирались на рабочую поверхность операционного стола.
Мыиспользовали маточный манипулятор Clermont-Ferrand («Karl Storz», Германия).Манипулятор устанавливается после обнажения матки в зеркалах, фиксации41шейки матки пулевыми щипцами и расширения цервикального каналарасширителями Hegar до № 8,5.Для уменьшения вероятности ранения крупных сосудов на этапе установкитроакаров пациентка переводится в положение Тренделенбурга (20-30°) толькопосле их введения.
Для проведения вмешательства использовали лапароскопHopkins II (30°) («Karl Storz», Германия) и стандартные механические иэлектрохирургические инструменты («Karl Storz», Германия; «Covidien», США):маточный манипулятор типа Clermont-Ferrand («Karl Storz», Германия); мягкий ижесткий 5 мм зажим; жесткие зажимы 10 мм; иглодержатель; толкатель (pusher)дляэкстракорпоральногозавязыванияузлов;интегрированныеножницыThunderBeat («Olympus», Япония) и биполяр LigaSure 10 мм («Cоvidien», США);морцеллятор RotoCut («Karl Storz», Германия); монополярный электрод типакрючок; биполяр RoBi («Karl Storz», Германия).Эндоскопические операции проводили при использовании видеосистемыFULL HD («Karl Storz», Германия), обеспечивавшей получение изображениявысокого разрешения.Миомэктомию без редукции кровотока выполняли по традиционнойметодике, когда после обзорной лапароскопии, ревизии органов брюшнойполости и малого таза, уточнялся размер и локализации узлов, состояниепридатков матки, наличие спаечного процесса и очагов эндометриоза.
Разрезмиометрия над узлом выполнялся при помощи L-образного электрода, узелвылущивался при помощи зажимов с поэтапной коагуляцией кровоточащихсосудов. Дефект на матке ушивали мышечно-мышечными швами и серозномышечными швами нитью Монокрил «0».Миомэктомию с редукцией артериальной перфузии (Метод временнойокклюзии маточной артерии- патент РФ на изобретение № 2407467)осуществляли по следующей методике: после инсталляции инструментов иревизии органов брюшной полости и малого таза с обеих сторон визуализировализону бифуркации общих подвздошных артерий и мочеточники. Производиливскрытие париетальной брюшины над внутренними подвздошными артериями42(ВПА) на протяжении 2-3 см, после чего мочеточники отводили латеральнее.Далее, путем послойной диссекции, выделяли ВПА.
На выделенные сосуды спомощью зажима Endoclinch («Cоvidien», США) накладывали мягкие сосудистыезажимы типа «De Bakey». После пережатия ВПА выполняли стандартнуюпроцедуру МЭ, которая в условиях временной окклюзии сосудов проходит сминимальной кровопотерей и практически не требует коагуляции миометрия. Поокончании операции выполняется санация брюшной полости, ее ревизия, снятиесосудистых зажимов и контроль гемостаза.При ушивании миометрия накладывали мышечно-мышечные швы нитьюМонокрил «0» или V-lock 180 «0» и серозно-мышечные швы нитью Монокрил«0».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
