Диссертация (1141076), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Свет, разложенный по длинам волн,попадает на регистрирующее устройство – малошумную 3648пиксельную ССD - линейку, работающую при комнатной температуре.Для данного комплекса была специально разработана системаподавления рэлеевского рассеяния и встроенный программируемыймикроконтроллер, который обеспечивает гибкость в управленииспектрометром.4. Спектры неупругого рассеяния света и сигналы флуоресценции сисследуемых веществ фиксировались в компьютере с помощьюспециальнойпрограммы,написаннойдляуправленияданнымкомплексом.
Программное обеспечение EnSpectrPro® автоматическиуправляло всеми элементами, задействованными в процессе измеренияспектрального сигнала. Кроме того, математический блок программыпроизводил автоматическое сравнение полученного спектральногосигналасэталоннымиспектрами33веществ,хранящимисявспектральной базе данных [94], и выдавал результат распознаванияспектра.Уникальная комбинация параметров прибора позволяла в течениеодной секунды производить измерение спектра исследуемого вещества,определение спектрального положения и относительных интенсивностейрамановских и флуоресцентных линий – своеобразных “отпечатков пальцев”исследуемой субстанции, а также их поиск и сравнение со спектральнойбазой данных известных веществ.Рисунок 1.
Схема устройства раман-флуоресцентного программноаппаратного комплекса.Полученные данные, будучи по своей сути многомерными имногопараметрными (длина волны рассеянного излучения, интенсивностьфлуоресценции и рамановского рассеяния) анализировали с использованиемметода дискриминантного анализа с помощью проекции на латентныеструктуры (PLS-DA). Суть метода состояла в том, что дискриминационныеправила для классов были заданы линейными регрессионными уравнениями.Из регистрируемых данных, интенсивности раман-флуоресцентных спектровна определенных сдвигах волн, составляли матрицу, где каждому образцуприсваивали значение 0 или 1, в зависимости от принадлежности классу34сохранной (0) илиопухолевой ткани (1). Регрессионную задачу решалиметодом проекций на латентные структуры, что позволило в дальнейшемпредсказывать принадлежность новых образцов.
Также PLS-DA позволилвыявить спектральные особенности для классов, связанных с наличиемсоединений и молекул, определяемых в качестве опухолевых маркеров,находившихся в ткани почки. Перед применением метода PLS-DAрегистрируемые данные были избавлены от шума методом Савицкого-Голея[108] и фонового излучения методом коррекции опорной линии сиспользованием ассиметричных наименьших квадратов [53] . Все методыпредобработки и многомерный анализ были реализованы в онлайнпрограммном обеспечении ТРтcloudbeta.Статистические методы исследованияСтатистическую обработку данных выполняли на персональномкомпьютере с помощью электронныхтаблиц Microsoft Excelи пакетаприкладных программ Statistica for Windows 7,0 (Stat.Softinc.США). Всеполученные количественные, анамнестические, клинические, лабораторные иинструментальные данные обрабатывали с помощью метода вариационнойстатистики.Вописательноймаксимальныеквадратическиеошибкизначения,статистикесредниеотклонения,среднихзначений,использовалисьарифметическиесредниеминимальныезначения,квадратическиеотносительныеисредние(стандартные)величинычастотыираспределения.Дляоценкивзаимосвязинесколькихпризнаковпроводиликорреляционный анализ по Спирмену и/или Пирсону.
Различия считалисьстатистически достоверными при значении р менее 0,05.35ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Результаты иммуноморфологического и спектроскопическогоисследований образцов светлоклеточного почечно-клеточного ракаМакроскопически опухоль, за исключением одного случая диффузногопоражения, имела вид светло-жёлтого узла, диаметр которого варьировал от2,2 до 5,8 см (средний размер составил 3,96+0,41 см), окруженного более илименее выраженной псевдокапсулой, толщиной от 0,1 до 0,4 см, белесоватоговидаедвазаметноговолокнистогостроения.Благодаряналичиюпсевдокапсулы опухолевый узел сохранял свои очертания.
Во всех случаяхповерхность разреза опухолевого узла носила отпечаток реализовавшихсявторичных изменений, среди которых преобладали очаговые или очаговосливныефокусыкровоизлиянийинекрозов.Вполовинеслучаев,псевдокапсула опухолевого узла была отделена от визуально неизмененнойткани почки зоной повышенного кровенаполнения.Несколько чаще опухолевый узел локализовался в левой почке - у 35больных, чуть реже в правой почке - у 32 пациентов (p>0,05).
Прорастаниеопухоли в близлежащие органы и ткани было отмечено в 15 (22,38%)случаях, при этом в половине случаев в патологический процесс быливовлечены околопочечная клетчатка, сосудистая ножка и почечная лоханка.В 3 случаях (4,47%) развитие опухоли осложнилось распространеннымгематогеннымметастазированиемвлегкие,печень,коститазаипозвоночник.В случае светлоклеточного варианта почечно-клеточного рака насветооптическом уровне при исследовании образца, полученного изцентральной части опухолевого узла, опухоль состояла из полиморфныхполигональных, либо округло-овальных клеток со светлой оптически пустойцитоплазмой,образующихальвеолярные36илидольковыеструктуры,разделенныетонкопетлистойсетьюсоединительнойткани.Клеткисущественным образом отличались друг от друга размером и формой ядер,наличиемилиотсутствиемядрышек,идентифицируемойилинеидентифицируемой структурой хроматина, а также его расположением:очаговым, диффузным или маргинальным.Раман-флуоресцентные спектры образцов светлоклеточного рака,полученные непосредственно из центра опухолевого узла имели характерныеособенности в виде набора специфических своеобразных «пиков» вдиапазоне от 1000 до 2980 см-1, которые отличались друг от другаположением и интенсивностью в зависимости от степени дифференцировкиопухоли.
Пик 1003см-1 соответствовал рассеянию молекул фенилаланина,1157см-1–метионина, 1517см-1и 2965см-1 различным модификациям бетакаротина (данное сочетание рамановских пиков отмечено в 100% случаев), а2977см-1 молекулам холестерина (в 16,6% случаев). Локальный максимумфлуоресценции соответствовал значению 2497+33,02 см-1 и был обусловленфлуоресценцией эндогенных порфиринов (Рис. 2).37АБРисунок 2. Результаты гистологического и спектроскопическогоисследований образца светлоклеточного варианта ПКР в центральномучастке опухолевого узла. А.
Опухолевые клетки с оптически пустойцитоплазмой, наличие единичных мелких ядрышек (степеньдифференцировки G2 по Фурману) Окраска гематоксилином и эозином. Ув.Х400. Б. Раман-флуоресцентный спектр, соответствующий центральнойобласти опухолевого узла. Локальный максимум флуоресценции обозначенжелтой вертикальной линией и соответствует флуоресценции эндогенныхпорфиринов (2497 см-1). Рамановские пики обозначены числовымизначениями, соответствующие рассеянию молекул фенилаланина (1003 см-1),метионина (1157 см-1), различным модификациям бета-каротина (1517 см-1 и2965 см-1).38Патогистологическая характеристика образца, полученного из участка,расположенного на периферии опухолевого узла, в целом, содержала наборпризнаков, свойственных центроузловым образцам, однако значительнаячасть клеток была лишена ядер, а сами клеточные элементы опухолирасполагались более упорядочено.
По своим спектральным характеристикампериферические участки по существу не отличались от центроузловых, ноимели сравнительно низкую интенсивность рамановского рассеяния света,чтонасоответствующихспектрахпроявлялосьменьшейвысотойрегистрируемых пиков. Вместе с тем, и значения частот, и наборрассеиваемыхмолекул, был идентичен, однако локальный максимумфлуоресценции эндогенных порфиринов был несколько снижен (Рис.3).39АБВРисунок 3. Результаты гистологического и спектроскопическогоисследований образца светлоклеточного варианта ПКР участка напериферии опухолевого узла. А.
Опухолевые клетки с оптически пустойцитоплазмой,наличие единичных мелких ядрышек (степеньдифференцировки G2 по Фурману) Окраска гематоксилином и эозином.Ув. Х100. Б. Тот же участок. Ув. Х400. В.Раман-флуоресцентный спектр,соответствующий периферической области опухолевого узла. Локальныймаксимум флуоресценции обозначен желтой вертикальной линией исоответствует флуоресценции эндогенных порфиринов (2250 см-1).Рамановские пики обозначены числовыми значениями, соответствующиерассеянию молекул фенилаланина (1003 см-1), метионина (1157 см-1),различным модификациям бета-каротина (1517 см-1 и 2965 см-1).40В дальнейшем,в зависимости от наличия и вариабельностивышеперечисленных признаков все случаи были распределены по степенямдифференцировки на четыре стадии (S.A.Fuhrman) игистологическиехарактеристики сопоставлены с результатами, полученным в ходе раманфлуоресцентнойспектроскопии.Наибольшаяинтенсивностьпиковрамановского рассеяния отмечена у образцов светлоклеточного рака свысокой степенью дифференцировки, что соответствовало степени G1согласно шкале градаций Фурмана.
Кроме того, рамановские пики 582 см-1,2977 см-1 (холестерин) вообще не встречался в спектрах образцовсветлоклеточного рака со степенью дифференцировки G2-4 (p<0.05) (Рисунок4). Соотношения степени дифференцировки опухоли и интенсивностирамановского рассеяния пиков молекул фенилаланина, в-каротина ихолестеринаотраженывдиаграмме1.Вобразцахумереннодифференцированого (G2), низкодифференцированного (G3) инедифференцированного(G4)светлоклеточногоПКРзначенияинтенсивности рамановского рассеяния имели стойкую тенденцию кснижению по всем показаниям по мере уменьшения дифференцировкиопухоли и достигали минимум к G4 степени.Диаграмма 1.Уровень интенсивности рамановских пиков в зависимостиот степени дифференцировки светлоклеточного ПКР.41Таблица 5. Сопоставление интенсивности рассеяния рамановских пикови степени дифференцировки светлоклеточного варианта ПКР (согласношкале Фурмана).Пик рамановского рассеяния1003 см-1 (фенилаланин)1157 см-1 (метионин)1517 см-1 (в-каротин)2965 см-1 (в-каротин)Значения интенсивности рассеянияG1- 427,1+ 41,54 отн.ед.G2 - 354,2+ 64,12 отн.ед.G3 - 310,1+ 17,61 отн.ед.G4– 118,3+ 23,17 отн.ед.G1 - 1435,2+ 103,28 отн.ед.G2 – 710,6+ 78,9 отн.ед.G3 – 664,5+42,3 отн.ед.G4 – 413,7+ 64,5 отн.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
