Диссертация (1141076), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Создана принципиальноновая технология, включающая три этапа: первичная культуральнаяобработка образцов тканей человека для производства одноклеточныхсуспензий, обнаружение рамановских спектров на захваченных в «лазернуюловушку» клетках и диагностика ракового перерождения клеток с помощьюклассификации искусственных нейронных сетей. В настоящее времяобсуждаются преимущества данного метода по сравнению с классическойтканевой рамановской спектроскопией [118]. Molckovsky A.

c соавт.проанализировали52рамановскихспектраexvivo(20образцовгиперпластических полипов, 32 - аденоматозных). На основе спектральных25диагностических алгоритмов были определены аденоматозные полипы счувствительностью 91%, специфичностью 95%. In vivo аденокарциномыможно отличить от гиперпластических полипов с чувствительностью 100% испецифичностью89%.Инфракраснаярамановскаяспектроскопиядифференцировала гиперпластические полипы с высокой диагностическойточностью [92]. В работе Кручининой М.В. с соавт.

методом спектроскопиикомбинационного рассеяния света (раман спектроскопии) сыворотки кровивыявлены различия в интенсивности спектров у пациентов с колоректальнымраком разных стадий и с различной локализацией метастазов. Площади пиковраман спектров оказались достоверно ниже у больных колоректальным ракомпо сравнению со здоровыми, коррелируя со стадией процесса и наличиемметастазов [27].В единичных работах, посвященных использованию рамановскойспектроскопии в диагностике рака почки, исследователи, в качествеотличительных особенностей светлоклеточного варианта ПКР, отмечаютусиленную интенсивность рамановского рассеяния молекул фенилаланина[73], что, по их мнению, дает основание отнести их к группе опухолевыхмаркеров [75].Применение спектрометров с высокими разрешающимихарактеристикамипозволиловыявитьизмененияинтенсивностирамановского рассеяния света молекулами нуклеиновых кислот в тканиопухоли по сравнению с сохранной тканью почки, а также зарегистрироватьсущественные различия в интенсивности рамановского рассеяния в опухоляхразличной степени зрелости.

Кроме того, в ряде случаев применениерамановскойотдельныеспектроскопииаминокислотыпозволило(тирозин,нетолькотриптофан)идентифицироватьпоинтенсивностирамановского рассеяния света, но и выделить характерные для них диапазоныв качестве ключевых диагностических критериев. Так, группой ученыхStewart S., et al (2014) было отмечено гораздо более высокие значенияинтенсивности рамановского рассеяния света молекулами фенилаланина,тирозина и триптофана в случаях хромофобного варианта почечно26клеточного рака в сравнении с онкоцитомой почки [111].27ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯМатериал исследованияДля выполнения задач, поставленных в данном исследовании, былизучен материал, полученный у 85 больных раком почки (мужчин – 45,женщин – 40), находившихся на обследовании и лечении в НИИУронефрологии и репродуктивного здоровья человека Первого МГМУ имениИ.М. Сеченова Минздрава России. Средний возраст больных составил57+1,21 лет (Табл. 1). Исследовали почки или их фрагменты, удаленные входе операции радикальной нефрэктомии (93,2%) или частичной резекциипочки (6,8%) по поводу злокачественного новообразования почки. Учитываятот факт, что за исключением одного случая, при котором имело местодиффузное поражение почек (1,2%), опухоль имела вид узла, расположенногов верхнем (48,2 %) или нижнем (36,5%) полюсах, либо в среднем сегментепочки (14,1%), участки опухолевой ткани были получены из его центра, имеяв виду центр предполагаемой окружности.

Кроме того, были исследованы по2образцатканиспериферииопухолевогоузла,непосредственнопримыкающие к так называемой «псевдокапсуле» опухоли и включающие еёфрагменты. Помимо образцов опухолевой ткани исследовали по 2 участкапочечной паренхимы из визуально неизменённых участков, максимальноудаленных от опухолевого узла. Таким образом, у каждого пациента всегоисследовали по 5 образцов почечной ткани размерами 0,5 х 0,5 х 0,5 см (Iгруппа).

Контрольную группу (II группа) составили образцы почечной тканианалогичных размеров, полученные от 10 лиц (мужчин – 6, женщин – 4),умерших в возрасте до 40 лет от других заболеваний, клинически иморфологически не имевших признаков почечной патологии. Образец былизъят из верхнего полюса почки, отступив от её капсулы на 0,5 см. Среднийвозраст больных составил 32,5+ 1,59 года.28Таблица 1. Распределение больных раком почки по возрасту и полуПолВозраст больных (годы)25-35Мужской(абс,%)Женский(абс, %)Всего (абс, %)36-4546-55Всего56-6566-75>752(2,35%)4(4,7%)17(20%)15(17,65%)6(7,06%)1(1,18%)45(53,0%)2(2,35%)3(3,53%)14(16,47%)14(16,47%)5(5,88%)2(2,35%)40(47,0%)4 (4,7%)7 (8,23%)31(36,5%)29 (34,1%)11(13%)3 (3,52%)85(100%)В соответствии с классификацией Робсона (1982 г.) и TNM (2009 г.) опухолибыли распределены следующим образом: I стадии (T1N0M0) соответствовали30 (35,3%) наблюдений, II стадии (T2N0M0) – 41 (48,2%) наблюдений, IIIстадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) –13 (15,3%) наблюдений, IVстадии (T4N0M0, T4N1M0, ТлюбаяN2M0, TлюбаяNлюбаяМ1) – 1 (1,2%)наблюдение.В работе использовали следующие морфологические методы исследования: Гистологический Гистохимический ИммуногистохимическийГистологический методДлявыполнениягистологическогоисследованияобразцытканейфиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина,заливали в парафин.

Срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилиноми эозином и пикрофуксином по ван Гизону, подвергали обзорномуморфологическому анализу, при котором определяли гистологический типопухоли, степень дифференцировки, выраженность вторичных изменений ираспространенность опухолевого процесса.Для определения гистологического варианта почечно-клеточного рака29использоваликлассификацию ВОЗ(2004 г), согласно которой, вподавляющем большинстве случаев, был выявлен его светлоклеточныйвариант - 67 (79 %) случаев, папиллярный – 10 (12 %) и хромофобный – 8(9 %) наблюдений. Степень дифференцировки опухолевых клеток определялисогласно общепринятой шкале градаций по Фурману (1982) (Табл. 2).Таблица 2.Распределение пациентов по группам в зависимости отморфологической картины новообразования почкиПараметрГруппа контроля, n (абс)Значение10 (100%)Почечноклеточный рак, n (абс, %)Светлоклеточный вариантПапиллярный вариантХромофобный вариант85 (100%)67 (78,8%)10 (11,7%)8 (9,41%)Светлоклеточный, n (абс, %)67 (100%)Степень дифференцировки (согласно шкалеФурмана), n (абс, %)-G119 (23,3%)-G233 (49,2%)-G310 (14,92%)-G45(7,46%)Папиллярный, n (абс, %)10 (100%)-1 тип7 (70%)-2 тип3 (30%)Степень дифференцировки (согласно шкалеФурмана), n (абс, %)-G14 (40%)-G26 (60%)-G30-G40Хромофобный, n (абс, %)8 (100%)-классический вариант4 (50%)-эозинофильный вариант4 (50%)Гистохимический методВ ходе исследования проводили гистохимические реакции, позволяющиеоценить на наличие и распространенность склеротических изменений,выраженность экстрацеллюлярного матрикса с помощьюМассону.30трихрома поИммуногистохимический методИммуногистохимическое исследование опухолей почек проводили напарафиновых срезах с использованием стрептавидин-биотинового метода сприменениемдвухшаговойполимернойсистемывизуализации«EnVision+DualLinkSystem-HRP» Dako Cytomation.Каждое иммуногистохимическое исследование проводилось с постановкойположительного и отрицательного контроля для исключения вероятностиполучения ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.Отрицательный контроль исключал неспецифическое окрашивание.

Наконтрольный срез наносили фосфатно-солевой буфер без первичногоантитела.Положительныйконтрольподтверждалспецифическуюпоставленную иммуногистохимическую реакцию с данным антителом.На основании изучения основополагающих работ [91, 133], посвященныхдифференциальной диагностике между разновидностями почечноклеточногорака, нами были отобраны антитела к СК-7, Vimentin, CD10, позволяющиеподтвердить или опровергнуть тот или иной вариант (Табл. 3).Таблица 3. Панель антител, использованная в исследованииМаркерАнтитела(клон, ЛокализацияХарактеристикапроизводитель)CK-7OV-TL 12/30, DakoЦитоплазмаVimentincloneVimV9, DakoЦитоплазма31Относится к семейству белковпромежуточных филаментов.АнтителаклонаOV-TLокрашиваютцитоплазмуразличныхвидовклетокнормальногоинеопластического железистогоэпителия, включая эпителийпротоков.Виментинэкспрессируетсямезенхимальными клетками,фибробластами,клеткамигладкоймускулатуры,эндотелиальными клетками.CD10Порезультатамиинтенсивностьэкспрессиииммунногистохимическогоэкспрессии:менееДанныеантителаиспользуютсядляхарактеристикипопуляцийзлокачественных лимфом, вкоторыхэкспрессируетсяCD10.

Антитела используютсявсоставепанелидлядифференциациисветлоклеточногоракаипаппилярно-клеточного ракапочки.Мембрана56C6, Dako5%приполномклеток—исследованияотсутствииотрицательнаяоценивалиэкспрессии(-),или5-24%-слабоположигельная (+) , 25-74% — умеренно положительная (++) , более75%—выраженная (+++).Метод раман-флуоресцентной спектроскопииРаман-флуоресцентное исследование проводили с помощью программноаппаратного комплекса – анализатора, состоящего из микроскопа Olympus испектрометра ИнСпектр R532, разработанного ООО «ИнСпектр» (РУ №РЗН2015/2419 от 18.05.2015).

Длина волны лазерного изучения (532 нм), размерлазерного пятна в фокусе (10 мкм в диаметре) и мощность лазера (10 мВт)были стандартными, и их постоянство и стабильность обеспечивалисьтехническимихарактеристикамипрограммно-аппаратногокомплекса.Управление прибором, регистрацию и запись спектров производили спомощьюспециальнойкомпьютернойпрограммыИнСпектр,такжеразработанной сотрудниками ООО «ИнСпектр» (г. Черноголовка). Программаосуществляла идентификацию химических веществ, соединений и отдельныхмолекул и регистрировала изменения их количественного и качественногосостава при различных состояниях, а в нашей работе – в изучаемых группах.Раман-флуоресцентный программно-аппаратный комплекс использовался последующей схеме: (Рис.

1):321. Между лазером и полупрозрачным зеркалом располагали узкополосныйинтерференционныйсоответствующеефильтр,лазернойкоторыйчастоте,пропускалопределяемойизлучение,техническимихарактеристиками прибора.2. После фильтра лазерное излучение попадало на полупрозрачноезеркало и после прохождения через линзу фокусировалось на образецткани, предварительно фиксированный в 10% растворе формалина.3. Свет, рассеянный биологическим или любым другим веществом, послеотделения линии лазера Edge-фильтром попадал в спектрометрИнСпектр R532® SpecialEdition. В конструкции ИнСпектр R532®ScientificEdition была предусмотрена голографическая дифракционнаярешетка1800штрихов/мм,комбинациявысокоэффективныхселективных и отрезающих фильтров, а также 30 мВт одномодовыйлазер, обеспечивающий качественное спектральное разрешение 4 см-1и гарантирующий высокую точность измеренияв спектральномдиапазоне от 120 до 4000 см-1.

Характеристики

Список файлов диссертации