Диссертация (1140845), страница 12
Текст из файла (страница 12)
13,14).Рисунок 13. ПЦР-анализатор «Rotor Gene Q»72Рисунок 14. Набор праймеров фирмы «Литех»Образцымикробиологическогоматериала,культивированныеваэробных и анаэробных условиях на плотной питательной среде, оцениваливизуально и каждую колонию полученного бактериального микста,отличающуюся от других по одному или ряду признаков (форме, размеру,прозрачности, характеру края, окраске), снова переносили на плотнуюпитательную среду.
После культивирования каждая чашка с клонированнымиколониямиспектрометрапоступаланаMicroflexмасс-спектрометрию.(КомпанияБазаданныхBruker, Германия)масс-располагаетинформацией о 4500 видах бактерий с учетом их уникального сочетаниярибосомальных белков (Рис. 15).Идентификациямикробиологическогоматериаламетодомспектрометрии проводилась у 15 пациентов до и после лечения.Рисунок 15. Масс-спектрометр Microflex (Компания Bruker, Германия)73масс-Литическуюактивностьбактериофаговиантимикробнуюэффективность хлоргексидина 0,05% оценивали методом spot-тестирования(Рис.
16). Для этого образец клинического материала (15 образцов) впитательной среде в объеме 0,2 мл рассевали на стерильные агаровыепластинки (агар Brain Heart Infusion с добавлением 5% гемолизированнойбараньей крови). Посевы растирали шпателем для получения сплошногобактериального газона, в центр которого наносили 1 каплю препарата сбактериофагами или каплю хлоргексидина. Чашки с посевами инкубировалив соответствии со стандартными сроками и условиями культивирования.Учетрезультатовпроисходилпоследующемупринципу:антимикробная активность бактериофагов регистрировалась при полномотсутствииростакультурывместенанесениякаплисредствасбактериофагами.Рисунок 16.
Результаты spot-тестирования: на чашке Петри с бактериальнымгазоном регистрируется зона лизиса (указана стрелкой).Определение чувствительностимикрофлоры к антибиотикам на 15образцах проводили по методике С.М. Навашина (1982) методом диффузии вагар с помощью бумажных дисков, пропитанных антибиотиками (AmpicillinAMP25, Azithromycin AZM30, Gentamicin GEN30, Clazithromycin CLR1, CoTrimoxazole COT25, Metronidazole MT5, Nitrofurantoin NIT200, Ofloxacin OF5,Pipemidic Acid PA30, Rifampicin RIF30, Roxithromycin RO30, Trimethoprim TR,74Furazolidone FR50, Cefalexin CN30, Cephotaxime CTX3, Ceftriaxone CTR30,Ciprofloxacin CIP30, Chloramphenicol C30, Erythromycin E, Ertapenem ETP10).Интерпретация результатов: ++++ высокая чувствительность; +++средняя, ++ низкая, + практически отсутствует, - отсутствует.Изучали цитотоксичность следующих антимикробных средств:• геля «Фагодент»• 0,05% хлоргексидинИсследование проводили на клеточной линии КВ – эпидермоиднойкарциноме ротовой полости человека.
Клетки вносили в лунки 96-луночногомикропланшета («Costar») в количестве 30 тыс. клеток на одну лунку в 100 мклкультуральной среды. Затем в лунки добавляли тестируемые вещества (гель«Фагодент» и 0,05 %) в исходной концентрации, в двух-, пяти- идесятикратных разведениях в ростовой среде (ДМЕМ +10% FBS). Инкубациюпроводили в условиях СО2-инкубатора в атмосфере 5% СО2, 80% влажности ипри температуре 37°С в течение 20 минут и 1 часа. По окончании инкубациицитотоксичность измеряли с помощью МТТ теста.МТТ тест – это метод определения жизнеспособности клеточных культур.Егодействие основанорастворимыйжелтыйнабромидспособностиживыхклеток превращать3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия(МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТформазана (МТТ-ф).
Нежизнеспособные клетки такой способностью необладают. Интенсивность превращения МТТ в МТТ-ф отражает общийуровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и модулируетсяактивностью сопряженных ферментных систем, например, дыхательной цепипереноса электронов и т.д.Жизнеспособность клеток, обработанных исследуемым средством,выражается в процентах и вычислена по формуле:ЖСП (%)= (ОПэ-ОПср)/ОПкк*100Где: ОПэ– значение оптической плотности в опытных сериях;ОПср – значение оптической плотности в лунках со средой;75ОПкк – значение оптической плотности в лунках с контрольнымиклетками.Цитотоксичностьвыраженацитотоксическиминдексом(ЦИ)впроцентах.Расчет ЦИ проводится по стандартной формуле:ЦИ (%)= [1-(ОПэ-ОПср)/ОПкк]*100Где: ОПэ– значение оптической плотности в опытных сериях;ОПср – значение оптической плотности в лунках со средой;ОПкк – значение оптической плотности в лунках с контрольнымиклетками.Для изучения возможного влияния антисептиков (хлоргексидина 0,05%,ополаскивателя«Листерин»,ополаскивателя«Президент»наосноветриклозана) на активность бактериофагов рассчитывали концентрациюактивных бактериофагов к Staphylococcus aureus, содержащихся в геле«Фагодент», при его одновременном использовании с антисептиками постандартной методике.
В качестве модельного штамма бактерий использовалиStaphylococcus aureus.Исследуемыеантисептикисмешивалисгелем,содержащимбактериофаги, в соотношении 1:1, инкубировали при комнатной температурев течение 3-5 дней, после чего проводили титрование по Грациа. В качествеконтроля был использован физиологический раствор.Концентрацию активных бактериофагов определяли по концентрациифаговыхчастицбляшкообразующихпутёмстандартногоединицахнатитрованиясантиметрпокубическийГрациав(БОЕ/см3).Исследования проводили с антисептиками в исходных концентрациях, в двух, пяти- и десятикратных разведении и в трёхкратном повторении.762.6. Методы статистического анализаСтатистическая обработка результатов исследования проводилась спомощью стандартного набора инструментов офисного приложения MicrosoftOffice Excel 2013 [37,55,112,125].Вычислялись среднее арифметическое значение (M), стандартнаяошибка среднего (m).
Статистическая значимость полученных результатов (p)вычислялась с использованием критерия Стьюдента (t) и его интерпретации наосновании стандартной таблицы критических значений коэффициентаСтьюдента.Уровень значимости () соответствовал вероятности -ошибки равной5% (=0,05), статистически значимыми признавались результаты при p<0,05.77Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.3.1.Результатыанкетированияврачей-стоматологовповопросампрофилактики воспалительных процессовАнкетирование врачей-стоматологов о знании пародонтопатогенов и ихсвойств показало достаточно высокий уровень знаний в данной области (Табл.6).
Так, правильные ответы на вопрос о видах микроорганизмов, участвующих вформировании микробной биопленки и зубного налета, дали 90,1% опрошенных.Высокий уровень правильных ответов отражал знания врачей о видахмикроорганизмов, участвующих в этиопатогенезе кариеса и пародонтита(соответственно 87,1% и 82,2% верных ответов). В то же время знания о ролимикроорганизмов в этиопатогенезе периостита оказались невысокими (52,9%верных ответов).
Также недостаточные знания показаны по вопросамкультивирования микроорганизмов при их идентификации (77,7% верныхответов).Таблица 6.Оценка знаний врачами-стоматологами основ микробиологии полости рта, ролибактерий в патогенезе воспалительных заболеванийВерные ответы(кол-во %)ВопросКакие виды микроорганизмов участвуют в формированиимикробной биопленки и зубного налета?Какие виды микроорганизмов участвуют в этиопатогенезекариеса?Какие виды микроорганизмов участвуют в этиопатогенезепародонтита?Какие виды микроорганизмов участвуют в этиопатогенезепериостита?В каких целях создают анаэробные условия припланируемой идентификации патогенов?182/90,1176/87,1166/82,2107/52,9157/77,7На фоне очень частого использования рентгенологического методаобследованияпациентовгистологическийицитологическийметодобследования используется редко и еще реже применяется микробиологическое78исследование (Табл.
7). Так, из 202 опрошенных рентгенологический методвсегда используют 170 врачей (%), часто используют 30 врачей (%), иногдаиспользуют – 2 (%); не было специалистов, вообще не использующихрентгенологический метод обследования. Микробиологическое обследование,напротив, никогда не использовали 101 врачей (%), иногда использовали 56врачей (%), часто использовали 45 врачей (%); не было специалистов, всегдаиспользующих микробиологическое обследование.Таблица 7Частота использования дополнительных методов обследования врачамистоматологамиЧастота использования (кол-во/%)МетодВсегдаЧастоИногдаНикогдаРентгенологический170/84,230/14,92/1,00Гистологический28/13,968/33,750/24,856/27,7Цитологический2/1,072/35,666/32,762/30,7045/22,356/27,7101/50,0МикробиологическоеисследованиеСредства для профилактики различного действия в первую очередьиспользовались гигиенического (очищающего) действия (Табл.
8). Всегданазначались пациентам 168 врачами (%), часто – 16 (%), иногда – 14 (%); 4 врача(%) никогда не назначали гигиенические средства. Антисептические средстваназначали 114 врачей (%) всегда, часто – 60 (%), иногда – 26 (%), никогда – 2(%). Реминерализующие средства (в том числе для лечения гиперстезии) часто ииногда назначали 87 и 89 врачей соответственно (% и %), никогда не назначалиремтерапию – 24 врача (%), а 2 врача (%) назначали ее всегда.
Для леченияксеростомии большинство врачей никаких средств не назначали (176 человек,%), а 16 и 10 врачей назначали средства для лечения ксеростомии соответственноиногда и часто (% и %).79Таблица 8.Частота назначения в профилактических целях средств различного действия дляполости ртаЧастота использования/назначения (кол-во/%)Действие средстваВсегдаЧастоИногдаНикогдаГигиеническое (очищающее)168/83,216/7,914/6,94/2,0Антисептическое114/56,460/29,726/12,92/1,02/1,087/43,189/44,124/11,9010/5,016/7,9176/87,1Реминерализирующее, для лечениягиперстезииДля лечения ксеростомииПри анализе ответов по назначению лечебных средств различногодействия установлено, что средства с антибактериальным и антисептическимдействием назначается чаще всего: антибактериальные средства всегданазначают 46 врачей (22,87%), часто – 108 (53,5%), иногда – 40 (19,8%) и никогдане назначают – 8 (4,0%); антисептические средства всегда назначают 50 врачей(24,8%), часто – 120 (59,4%), иногда – 14 (6,9%), никогда – 18 (8,9%).Противопротозойные средства назначаются редко: никогда не назначают их 68врачей (33,7%), иногда – 76 (37,6%), часто – 44 (21,8%), всегда – 14 (6,9%) (Табл.9, Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
