Диссертация (1140744), страница 9
Текст из файла (страница 9)
/ Veillonella spp. / Dialister spp., Lachnobacterium spp. / Clostridium spp.,Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae),Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp. и Candida spp. Также было проведенообследование женщин методом ПЦР на наличие абсолютных патогенов:Chlamydiatrachomatis,Neisseriagonorrhoeae,Trichomonasvaginalisигерпесвирусов (ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ).Амплификацию осуществляли в режиме «реального времени» в объеме 35мкл по следующей программе: 1 цикл – 80ºС 30 сек, 94ºС 1 мин 30 сек; 5 циклов –94ºС 30 сек, 64ºС 15 сек; 45 циклов – 94ºС 10 сек, 10ºС – хранение 94ºС наприборе«ДТ-964»(«ДНК-Технология»,Россия).Измерениеуровняфлуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64ºС по каналамFAM, HEX и ROX. Обработка результатов осуществлялась автоматически спомощью программного обеспечения к приборам.Ультразвуковые методы исследования.Ультразвуковоеультразвуковоекардиографияисследованиеисследованиепроводились(УЗИ)в 1головногооргановсуткимозга(нейросонография),брюшнойполости,ЭХО-жизни, далее по показаниям сиспользованием прибора Vivid-q.Рентгенологические исследования.Рентгенография органов грудной клетки проводилась на передвижномпалатном рентгеновском съемочном аппарате SIEMENS MOBILETT XP Digitalвсем новорожденным в 1 сутки жизни, далее по показаниям.
Обследуемыйнаходился в положении лежа на спине симметрично, голова укладывалась поцентру. Исследование проводили с отсеивающей решеткой с кассетой 13×18 см,аппарат устанавливался над кювезом, на расстоянии 60 см от ребенка. Прианализе полученных рентгенограмм оценивали изменения легочной паренхимы,47особое значение имели следующие из них: очаговые тени, инфильтративныеизменения.Магнитно-резонансная томография головного мозга.Магнитно-резонансная томография проводилась на аппарате Magnetomverio (Siemens, Germany) новорожденным по показаниям: судорожный синдром,несоответствие клинической картины и степени структурных повреждений,определяемых при НСГ; отставание в психомоторном развитии.Молекулярно-генетические методы исследования.При исследовании профиля мРНК генов иммунного ответа методом ОТПЦР(количественнаяполимеразнаяцепнаяреакцияиметодобратнойтранскрипции) определяли представленность транскриптов генов цитокинов(IL12A, TNFА), транскрипционных факторов(TBX21, GATA3, RORC2),трансмембранного гликопротеина (CD68) в клетках буккального соскоба иклетках цельной крови новорожденных.
Во избежание деградации РНК взятиематериала производилось в пробирки со специальной транспортной средой(лизирующийраствор набора «ПробаНК»,«ДНК-технология»,Россия).Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, споследующими промываниями промывочным раствором. Объем образцов послевыделения составил 100 мкл. Для реакции обратной транскрипции использовалиобъем 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца).
В качестве праймеров дляобратной транскрипции использовали специфические олигонуклеотиды. Реакциюпроводили при температуре 40°С в течение 30 минут, с последующейинактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 минут. Дляувеличения объема образцов после обратной транскрипции кДНК разводили в 5развТЕ-буфере.Амплификациюосуществлялисогласноинструкциипроизводителя. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки.
Нормировкапроводилась по трем референсным генам TBP, B2M, GUSB, HPRT.Аналитическая чувствительность тест-систем составляла от 3 до 10 копийкДНК изучаемого гена на амплификационную пробирку, или от 180 до 600 копийна 1 мл образца. Для всех тест-систем область линейного диапазона составляла от4815 до 36 цикла значений индикаторного цикла (Ср), что соответствовалоконцентрациям от 10-50 до 108 копий на амплификационную пробирку.В работе использовались коммерческие реактивы («ДНК-технология»,Россия).
Производитель гарантировал отсутствие амплификации на матрицегеномной ДНК исследуемых иреференсных генов.Это позволило неиспользовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой.Исследования проводились в лаборатории молекулярно-генетических методов(руководитель к.м.н. Донников А.Е.).Морфологические методы исследования.С использованием морфологических методов исследовали 101 послед(плацента,оболочки,пуповина),полученныеприродахуженщин.Макроскопическим методом исследовалось состояние плаценты, плодныхоболочекипуповины,определялисьвидимыевнейизменения.Морфометрическим методом проводилось определение массы и размеровплаценты,видимыхмакроскопическихизмененийсиспользованиемпланиметрии.
В гистологических препаратах производился подсчет ворсин сразличной степенью васкуляризации. Исследования проводились в патологоанатомическом отделении (руководитель д.м.н. Щеголев А.И.).Консультации специалистов.С целью оценки степени влияния врожденных инфекций на показателифизического и нервно-психического развития детей с ОНМТ и ЭНМТ прирождении 79 пациентов проходили комплексный осмотр в возрасте 3, 6 и 12месяцев скорригированного возраста. Дети были консультированы следующимиспециалистами: педиатр, окулист, невролог, детский хирург.
Оценка нервопсихического развития проводилась с использованием шкалы Гриффитс. Приоценке физического развития использовалась центильная шкала, предложеннаяВОЗ [95]. По показаниям проводился осмотр кардиологом, детским хирургом,эндокринологом. Из методов обследования были выполнены клинический анализкрови, общий анализ мочи, УЗ-методы исследования (нейросонография, попоказаниям УЗИ органов брюшной полости, эхокардиография).
Консультации49осуществлялисьсотрудникаминаучно-консультативногоотделенияотделанеонатологии и педиатрии (заведующая отделением – д.м.н. Пекарева Н.А.).2.3. Статистическая обработка результатов.Статистическая обработка данных выполнялась с использованием пакетаприкладных программ «Statistica 8.0» (StatSoft Inc., США).
Поскольку вбольшинстве случаев распределение данных было отлично от нормального,использовалисьметодынепараметрическойстатистики.Количественныепризнаки описывались медианами и квартилями (Ме [LQ; UQ]). Качественныепризнаки описывались абсолютными и относительными частотами их значений.Для количественных признаков сравнение несвязанных групп проводилось сиспользованием непараметрического теста Манна-Уитни (U-test).
Для сравнениячастот значений признаков в группах применялся двухсторонний точныйкритерий Фишера (ТКФ). Различия считались статистически значимыми придостигнутом уровне значимости P<0,05.Оценка чувствительности и специфичности проводилась с использованиемследующих формул [51]:Se, % = a/ (a+c)Sp, % = d/ (b+d), гдеа - истинно положительные,b - ложно положительные,c - ложно отрицательные,d - истинно отрицательные.Припостроениибинарнойлогистическойрегрессионноймодели,использовался метод обратной селекции. Качество приближения регрессионныхмоделей при каждом последующем шаге оценивалось при помощи функцииподобия – отрицательного удвоенного значения логарифма этой функции (-2LL).Оценка качества полученных моделей проводилась с помощью ROC-анализа.Все дети в данном исследовании подбирались методом случайной выборкис учетом задач проводимого исследования.50Глава 3.Результаты исследований.3.1.Перинатальныефакторырискаразвитияврожденнойбактериальной инфекции у детей с ЭНМТ и ОНМТ.С целью оценки влияния состояния здоровья матери на состояниеглубоконедоношенных детей при рождении было выделено 2 группы матерейсогласно состоянию детей при рождении:1 группа - дети с врожденной инфекцией,1А подгруппа - дети с врожденным сепсисом (N=33),1Б подгруппа – дети с врожденной пневмонией (N=44),2 группа - дети без инфекции (N=83).Возраст обследуемых матерей составил в 1А подгруппе 33 [28;37] лет, в 1Бподгруппе – 31 [29;35] лет, во 2 группе – 31 [27;35] лет.
Группы матерей былисопоставимы по возрасту, достоверных отличий выявлено не было (р>0,05, Utest). В 1А подгруппе высшее образование было у 78,8% матерей, в 1Б родгруппе– 75%, во 2 группе – 75,9%.При анализе соматического здоровья матерей было выявлено, чтохроническая артериальная гипертензия статистически значимо чаще отмечается вгруппах новорожденных с врожденным сепсисом и врожденной пневмонией посравнению с контрольной группой (таблица 4). В 1А подгруппе в 21,2% и в 1Бподгруппе в 22,7% случаев хроническая артериальная гипертензия осложняласьпреэклапмсией.Анализ гинекологического здоровья матерей глубоконедоношенных детейпоказал, что хронические воспалительные заболевания половых органовстатистически значимо чаще встречаются в группе детей с врожденным сепсисоми врожденной пневмонией по сравнению с контрольной группой.
Таким образом,данное патологическое состояние гинекологического анамнеза матери стоитрассматривать как фактор риска развития врожденного сепсиса и врожденнойпневмонии у новорожденных (таблица 4).51Таблица 4 – Соматическое и гинекологическое здоровье матерей детей,родившихся с инфекцией и без инфекцииЗаболевание матери1АподгруппаN=331БподгруппаN=442 группаN=83р 1А-1Б,ТКФ*р 1А2,ТКФр 1Б2,ТКФ5(15,2%)7(15,9%)11(13,3%)>0,05>0,05>0,053(9,1%)3(6,8%)9(10,8%)>0,05>0,05>0,058(24,2%)10(22,7%)5(6%)>0,050,0090,0086(18,2%)4(12,1%)Хроническая артериальная10гипертензия(30,3%)Ожирение0*ТКФ-точный критерий Фишера9(20,5%)6(13,6%)16(36,4%)4 (9,1%)19(22,9%)14(16,9%)6(7,2%)3 (3,6%)>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,050,002<0,001>0,05>0,05>0,05Воспалительные заболеванияпочек (хр.гломерулонефрит,хр.пиелонефрит,)Хронический циститХронические воспалительныезаболевания половыхорганов**Хронические воспалительныезаболевания ЛОР-органовЗаболевания ЖКТ**хронический сальпингоофорит, хронический бартолинит, хронический эндометритТаблица 5 – Состав микробиоценоза цервикального канала матерейоснованный на данных бактериологического посева отделяемогоМикрофлораотделяемогоцервикальногоканала матерейЛактобактерииCandida spp.EnterococcusfaecalisEnterococcusfaeciumStaphylococcusaureusStaphylococcusepidermidisE.coliKlebsiellapneumonia1АподгруппаN=331БподгруппаN=442 группаN=83р 1А-2,ТКФр 1Б-2,ТКФ>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,054/20 (20%)17/23(73,9%)2/23 (8,7%)9/20 (45%)6/23 (26,1%)0/201/23 (4,3 %)0/201/23 (4,3%)0/53>0,05>0,05>0,050/201/23 (4,3%)5/53 (9,4%)>0,05>0,05>0,059/20 (45%)7/23 (30,4%)7/53(13,2%)>0,050,006>0,052/20 (10%)1/23 (4,3%)2/53 (3,8%)>0,05>0,05>0,0510/20 (50%)35/53(66%)8/5 (15,1%)18/53(34%)1/53(1,9%)р 1А-1Б,ТКФ52Анализ состава микробиоценоза цервикального канала материпоказал,чтовгруппематерейдетейсврожденнымсепсисомстатистически значимо чаще отмечается высев E.coli.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
