Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Министерство здравоохранения

Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

высшего образования

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени И.М.СЕЧЕНОВА

(Сеченовский Университет)

На правах рукописи

Басова Александра Анатольевна

Определение молекулярных маркеров для ранней диагностики и оценки эффективности лечения хронического генерализованного пародонтита

Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

14.01.14 – стоматология

Научный руководитель:

д.м.н. Зорина О.А.

Москва – 2017

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16

1.1. Исследование состава микробного консорциума пародонта человека методами молекулярного анализа 16

1.2. Симбиотические взаимоотношения бактерий в составе биоплёнок полости рта и их роль в развитии пародонтита 25

1.3. Лечение хронического генерализованного пародонтита с использованием местной антибактериальной терапии 29

1.4. Обзор современных достижений клинического применения ФДТ в медицине, в том числе при лечении пародонтита 35

1.5. Заключение по обзору литературы 41

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 44

2.1. Состав выборки пациентов и протокол исследования 44

2.2. Клинические методы обследования пациентов 47

2.3. Рентгенологические методы исследования 49

2.4. Молекулярно–генетические методы исследования 50

2.4.1. Получение образцов биологического материала 50

2.4.2. Методика выделения ДНК 52

2.4.3. Проведение ПЦР в режиме реального времени 53

2.4.4. Нормировка данных 57

2.5. Методы лечения ………59

2.5.1. Методика профессиональной гигиены полости рта 59

2.5.2. Методика применения геля «Метрогил-Дента» 60

2.5.3. Методика фотодинамической терапии 61

2.6. Методы статистического анализа 66

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 68

3.1. Результаты клинической оценки эффективности фотодинамической терапии в сравнении с применением геля «Метрогил-дента» в составе комплексного лечения пациентов с ХГП 68

3.2. Сравнительный анализ представленности ДНК–маркеров пародонтопатогенов и потенциальных пародонтопротекторов у пациентов с ХГП и лиц с интактным пародонтом 75

3.3. Изменение представленности ДНК–маркеров пародонтопатогенов и потенциальных пародонтопротекторов у пациентов с ХГП после проведенного лечения 79

ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 95

Выводы 107

Практические рекомендации 109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 111

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Хронический генерализованный пародонтит в настоящее время является чрезвычайно распространенным заболеванием во всем мире [Кузьмина Э.М. с соавт., 2009; Янушевич О.О. с соавт., 2015; Wolf D.L., Lamster I.B., 2011; Preshaw et al., 2015]. Риск развития пародонтита зависит от многих факторов, но, в конечном итоге, определяется составом микробиома пародонта, который как в норме, так и при патологии отличается высокой динамичностью [Дмитриева Л.А., 2007; Царев В.Н. с соавт., 2008; Грудянов А.И. с соавт., 2011; Зорина О.А. с соавт., 2011, 2012; Янушевич О.О. с соавт., 2015; Paster B.J. et al., 2006; Deas D.E., Mealey B.L., 2010; Malik R. et al., 2010].

По результатам микробиологических исследований последних десятилетий были выявлены роды, наличие которых в слюне и десневой жидкости устойчиво ассоциируется с патологическим состоянием пародонта: Aggregatibacter, Porphyromonas, Prevotella и Tannerella [Socransky S.S. et al., 2013; Bai D. et al., 2015]. Имеются отдельные указания на патогенетическую роль в развитии пародонтита других родов: Capnocytophaga, Synergistetes и Filifactor [Griffen A.L. et al., 2012]. В ходе прогрессирования заболевания у пациентов образуются глубокие пародонтальные карманы, в которых происходит накопление таких анаэробных патогенов, как A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia [Кулаков А.А. с соавт., 2011; Зорина О.А. с соавт., 2011; Haffajee A.D. et al., 2006, 2008; Atieh M.A., 2008; Braga R.R. et al., 2010; Elamin A. et al., 2011; Torrungruang K. et al., 2015].

Что касается состава нормальной микрофлоры пародонта и её антагонистической роли в отношении патогенов, то этот вопрос в литературе практически не поднимается. Hajishengallis G. et al. (2014) считают, что практически все виды бактерий, массово присутствующие на пародонте, вовлечены в формирование биоплёнки, и в виду этого должны рассматриваться в качестве условных патогенов. Ссылаясь на работу Yost S. et al. (2015) и другие публикации на эту тему, авторы делают вывод, что практически любые комменсальные бактерии пародонта могут активировать свой потенциал патогенности под влиянием бактерий – инициаторов заболевания (прежде всего P. gingivalis). Роль естественных антагонистов пародонтопатогенов практически не исследована, а восстановление нормального биоценоза полости рта сводится к использованию пробиотических препаратов на основе лактобацилл и бифидобактерий.

Учитывая важную роль микробного фактора в развитии хронического пародонтита, практически во всех схемах лечения активно используются антибиотики или другие бактерицидные средства [Jin L.J. et al., 2011]. Однако пародонтопатогенные бактерии, в частности, A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis обладают способностью к инвазии в глубоколежащие структуры пародонта, что позволяет им сохранять жизнеспособность при механическом удалении биопленки и местном применении антимикробных средств [Amodini Rajakaruna G. et al., 2012; Hajishengallis G., 2014].

Системное назначение антибактериальных препаратов в сочетании с профессиональной гигиеной полости рта, как правило, обеспечивает выраженное улучшение клинической картины по сравнению с лечением без применения антибиотиков, но антибактериальные препараты обладают целым рядом побочных системных эффектов, а также способны оказывать негативное влияние на состав микробиома пародонта [Haffajee A.D., 2006; Slots J., 2012; Mombelli A., 2012; Mdala. et al., 2013; I. Silva–Senem M.X. et al., 2013].

В работе Van Winkelhoff A.J. et al. (2016) показано, что использование антибиотиков приводит к резкому увеличению представленности нетипичных для пародонтального консорциума человека видов сапрогенного происхождения или характерных для животных, в частности, Bordetella bronchispetica, Pasteurella canis, Pasteurella pneumotropica и Neisseria zoodegmatis. Нерациональное применение антибиотиков способствует селекции штаммов бактериальных культур с множественной устойчивостью к антибактериальной терапии [Супотницкий М.В. 2011; ВОЗ, 2013; Herrera D. et al., 2008; Garcez A.S. et al., 2010; Rams T.E. et al., 2011; Marcinkiewicz J. et al., 2013; Soares G.M. et al., 2014].

В качестве альтернативы антибиотикотерапии или её дополнением в последнее время является использование антимикробных средств на основе активных форм кислорода: озонотерапия и фотодинамическая терапия (ФДТ) [Shin D et al., 2016; Monzavi A. et al., 2016; Decker E.M. et al., 2016]. Теоретически пародонтопатогены, являясь облигатными анаэробами, должны обладать высокой чувствительностью к ним, однако, реальная эффективность, избирательность действия и стойкость достигаемого лечебного эффекта остается неизученной. В настоящее время практически нет сведений о влиянии антимикробной фотодинамической терапии пародонтита на соотношение в микробиоме патогенной и протекторной микрофлоры, что не позволяет оценивать долговременность достигаемого лечебного эффекта и повышает риск назначения неадекватного лечения.

Степень разработанности темы исследования

В последние годы в арсенале исследователей появился новый инструмент анализа микробных консорциумов на основе глубокого секвенирования банков 16S рДНК (NGS). В ряде работ [Jünemann S. et al., 2012; Laksmana T. et al., 2012; Schwarzberg K. et al., 2014; Bizzarro S., 2016; Van Winkelhoff A.J., 2016] описаны результаты применения этого метода для исследования консорциумов пародонта человека. Во всех перечисленных исследованиях, выполненных при помощи метагеномного секвенирования, отмечается кратковременность влияния антибиотикотерапии на состав микробиома.

В работе отечественных авторов [Zorina O.A. et al., 2014] описано исследование микробиома пациентов с агрессивным пародонтитом и со здоровым пародонтом, выполненное методом глубокого секвенирования, в результате которого выдвинуто предположение о роли Veillonella parvula и Streptococcus sanguinis в качестве потенциальных пародонтопротекторов. Однако выводы этого исследования выполнены на малом контингенте больных и нуждаются в подтверждениях в дальнейших исследованиях в репрезентативных группах с применением экспресс–методов. Более того, неисследованной осталась роль этих бактерий в развитии хронического пародонтита. Следует отметить, что применение метода NGS ограничивается в основном исследовательскими целями ввиду его трудоемкости и высокой себестоимости.

Помимо глубокого секвенирования для исследования количественных соотношений между бактериями может использоваться такой быстрый, эффективный и общедоступный метод молекулярного анализа, как ПЦР в реальном времени. На сегодняшний день уже разработан ряд тест–систем и выпускаются коммерческие наборы для проведения анализа пародонтопатогенов методами ПЦР в реальном времени. Одним из наиболее подробных исследований микробиома пародонта методом ПЦР в реальном времени остается исследование Torrungruang K. et al. (2015) «Коинфекция P. gingivalis, A. actinomycetomcomitans и T. denticola, P. intermedia ассоциирована с тяжелой формой пародонтита в тайской популяции». Несмотря на широкое применение метода ПЦР в пародонтологии, в литературе имеются лишь отрывочные сведения о соотношении патогенной и протекторной микрофлоры полости рта при пародонтите и динамике численности патогенов после применения антибиотиков.

Таким образом, нерешенной задачей остается определение соотношений численности потенциальных пародонтопротекторов и пародонтопатогенов в норме, в острой фазе пародонтита и после проведенного лечения с применением антимикробных средств.

Цель исследования

Повышение эффективности лечения пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом за счет разработки количественных диагностических критериев для анализа изменений состава микробиома пародонтального кармана и применения фотодинамической терапии.

Задачи исследования

1. Разработать критерии диагностики хронического генерализованного пародонтита на основе молекулярно-генетических маркеров и получить референсные значения, характерные для лиц с интактным пародонтом.

2. С помощью молекулярного анализа методом ПЦР в реальном времени охарактеризовать количественные соотношения представленности в поддесневой биопленке 5 пародонтопатогенов (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola) и двух потенциальных пародонтопротекторов – V. parvula и S. sanguinis у пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней.

3. Оценить клиническую эффективность применения фотодинамической терапии в сравнении с традиционными методами антимикробной обработки пародонтальных карманов в комплексном лечении пациентов с ХГП.

4. Изучить с помощью метода ПЦР динамику микробного состава поддесневой биопленки у пациентов с ХГП после проведенного комплексного пародонтологического лечения с применением фотодинамической терапии в сравнении с местной антибактериальной терапией.

5. Разработать рекомендации по включению местной антибактериальной терапии и фотодинамической терапии в комплексное лечение пациентов с ХГП в зависимости от состава поддесневой микрофлоры, а также по применению методов молекулярного анализа микробиома пародонтального кармана для высокоточной диагностики хронического генерализованного пародонтита.

Научная новизна исследования

Характеристики

Тип файла документ

Документы такого типа открываются такими программами, как Microsoft Office Word на компьютерах Windows, Apple Pages на компьютерах Mac, Open Office - бесплатная альтернатива на различных платформах, в том числе Linux. Наиболее простым и современным решением будут Google документы, так как открываются онлайн без скачивания прямо в браузере на любой платформе. Существуют российские качественные аналоги, например от Яндекса.

Будьте внимательны на мобильных устройствах, так как там используются упрощённый функционал даже в официальном приложении от Microsoft, поэтому для просмотра скачивайте PDF-версию. А если нужно редактировать файл, то используйте оригинальный файл.

Файлы такого типа обычно разбиты на страницы, а текст может быть форматированным (жирный, курсив, выбор шрифта, таблицы и т.п.), а также в него можно добавлять изображения. Формат идеально подходит для рефератов, докладов и РПЗ курсовых проектов, которые необходимо распечатать. Кстати перед печатью также сохраняйте файл в PDF, так как принтер может начудить со шрифтами.

Список файлов диссертации