Диссертация (1140612), страница 8

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

Рисунок 3. Детектирующий амплификатор «ДТ–96» (НПФ «ДНК–Технология»).

В работе был использован разработанный ранее набор реагентов, состоящий из специфичных праймеров и флуоресцентно меченой разрушаемой пробы (типа TaqMan) для определения пяти пародонтопатогенов (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, T. denticola) и общей бактериальной массы на основе консервативного участка гена 16S рРНК [Зорина О.А. с соавт., 2011].

Aggregattibacter actinomycetemcomitans (ген глутаредоксин 2 (glrA))

Aa–gl1s1 5'–CGC CTA GGG CTG CCT GAA T–3'

Aa–gl1a1 5'–GCA GGT GAG GTT GCG CAG GA–3'

Aa–gl1pt3 (BHQ1)–5’–TTC GCC CGC C(FdT)C GCC CCT GA–3’–P

Porphyromonas gingivalis (ген nah)

Pg–na1s1 5'– TCC GAC CGT CGA GCC TGT T –3'

Pg–na1a1 5'– CTG CCA CAG CCA GTA GCC TT –3'

Pg–na1pt1 (BHQ1)–5’– GCC GAA AGA A(FdT)T GCC GGC CG –3’–P

Prevotella intermedia (локус pin0048 гена InpA)

Pi–in1s2 5'– CAC TTG GCA AGC ACA AAA TGA A –3'

Pi–in1a2 5'– TGG GGT TAT CGG TTT CTA CGA A –3'

Pi–in1pt3 (BHQ1)–5’– CGC ACC CGA AC(FdT) GCT TGG CG –3’–P

Tannerella forsythia (ген bspA)

Tf–1s1 5'– TGG CAC CCT CCG ATG CCG AC –3'

Tf–1a1 5'– GCG CAG ACC GTT GGG TTT CA –3'

Tf–1pt1 (BHQ1)–5’– CCG CGC CCG A(FdT)G CGT CGC TGG C –3’–P

Treponema denticola (ген licCA)

Td–1s1 5'– TAG CCG GAA AAA CGA AGG AGT G –3'

Td–1a1 5'– CCC TGC TTG TTT GCA AAC ATA G –3'

Td–1pt1 (BHQ1)–5’– AAC CCA GCC G(FdT)T TCG TCC TCC GAC –3’–P

Общая бакмасса (16S рРНК)

16S–1s1 5'– ACG CGA AGA ACC TTA CCA GGA C –3'

16S–1a1 5'– TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGA C –3'

16S–1pt1 (BHQ1)–5’– TGC TCC ACC (FdT)CG CGG TCT TGC GTC –3’–P

Наряду с этим, исследовали содержание в образах двух потенциальных пародонтопротекторов: V. parvula и S. sanguinis.

Для идентификации V. parvula использовался следующий набор праймеров и зондов:

Veil–d2 ATCGGTTCTTTCATCATCGCTATT;

Veil–r2 TTAGTGGGTCAAAACCTACGGCAA;

Veil–p2 (BHQ1)–GCGGCACCT(FdT)CAAGGGCACCAGTG–P.

где BHQ1 – тушитель флуоресценции Black Hole Quencher 1, FdT – тимин, меченный флуорофором FAM.

Праймеры для идентификации S. sanguinis:

Sang-1 GGATAGTGGCTCAGGGCAGCCAGTT

Sang-2 GAACAGTTGCTGGACTTGCTTGTC

Праймеры имели расчётную температуру отжига 60,6С и 61,1С и обеспечивали синтез продукта длиной 322 п.н. Расчётная температура плавления зонда составила 69,5С.

Указанные реагенты использовали для проведения ПЦР в реальном времени, которая представляет собой процесс амплификации ДНК путем повторяющихся циклов температурной денатурации ДНК, отжига праймеров (затравок) с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеиновых цепей ДНК–полимеразой.

Для детекции результатов амплификации использовали ДНК–зонды, каждый из которых содержал флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК–зонд разрушался, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) возрастало пропорционально количеству образовавшихся специфических амплификатов и измерялось на каждом цикле амплификации.

ДНК–зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой ДНК и внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками Fam и Hex соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации ДНК исследуемых образцов.

Для повышения чувствительности и специфичности реакции применялся «горячий» старт, который обеспечивался методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенной прослойкой из парафина. ПЦР с «горячим» стартом позволяет минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа, поскольку смешивание слоев и превращение их в амплификационную смесь происходит только при плавлении парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК–мишени при начальном прогреве пробирки.

Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, маркировали согласно количеству анализируемых образцов.

Во все промаркированные пробирки добавляли раствор Taq–полимеразы.

Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К– – отрицательный контрольный образец, К+ – положительный контрольный образец) вносили 5 мкл анализируемого препарата ДНК или кДНК.

Контрольные образцы необходимы для исключения ложных результатов, возникающих вследствие артефактов детекции. В пробирку К– вносили отрицательный контрольный образец (должен давать отрицательную реакцию, так как сам образец не содержит фрагментов ДНК, необходим для контроля чистоты реактивов). В пробирку К+ вносили положительный контрольный образец (всегда дает положительную реакцию, так как уже содержит клонированный фрагмент специфической ДНК, необходим для проведения сравнения результатов с опытными образцами).

Амплификацию проводили согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. С помощью программного обеспечения получали отчет о проведенном исследовании в графическом и цифровом виде для трактовки результатов реакции.

Основным преимуществом ПЦР в реальном времени является возможность количественного определения ДНК в исследуемом материале. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции в координатах «уровень флуоресценции - цикл амплификации», которая имеет сигмоидную форму (Рисунок 4). В ней можно выделить три стадии: стадию инициации, когда продукты ПЦР еще не детектируется флуоресцентной меткой; экспоненциальную стадию, в которой наблюдается экспоненциальное увеличение сигнала флуоресценции за счет накопления ампликонов; плато, обусловленное истощением компонентов реакционной смеси.

Рисунок 4. Анализ результатов ПЦР в реальном времени по кривой флуоресценции с определением значений порогового цикла Ct.

Результаты ПЦР в реальном времени регистрировали по значению порогового цикла Сt, который представляет собой очередной по счету цикл амплификации, когда кривая флуоресцентного сигнала пересекает линию порога фоновой флуоресценции.

2.4.4. Нормировка данных

Анализ данных ПЦР в реальном времени позволяет судить как о присутствии или отсутствии искомой ДНК, так и оценить ее начальное количество за счет регистрации накопления продуктов амплификации в течение всей реакции. Количество исследуемой ДНК выражают в абсолютных или относительных значениях. Определение абсолютных значений применяют для расчета количества копий ДНК в пробирке. Для этого необходим внешний контроль с известной концентрацией ДНК-мишени.

Показатель Сt строго коррелирует с исходным количеством ДНК в исследуемом образце (существует линейная обратно-пропорциональная зависимость от логарифма количества исходной ДНК), поэтому может применяться в качестве количественного критерия содержания микроорганизмов в пробе (чем меньше значение Ct, тем выше содержание ДНК в пробе).

Однако количественное определение какого-либо вида бактерий в микробиоценозе в абсолютных цифрах малоинформативно, поскольку полученные данные зависят от количества взятого биоматериала и эффективности экстракции ДНК. В связи с этим, необходима нормировка относительного количества каждого определяемого микроорганизма на некий показатель, присущий каждому образцу и пропорциональный количеству взятого биоматериала.

Для определения соотношения пародонтопатогенов в образцах, Ct каждого маркера нормировали относительно общей бактериальной массы, представленной в образце (детекция по консервативному участку гена 16S рРНК). Нормировка по общей бактериальной массе дает важную информацию о соотношении исследованных патогенных бактерий и обсемененности исследуемого биотопа, что крайне информативно для оценки состояния микробиоценоза, и, как следствие, более точной диагностики состояния пациента [Зорина, О.А. Нормировка данных при количественном исследовании пародонтопатогенной микрофлоры методом ПЦР «в реальном времени». / О.А.Зорина, А.А. Кулаков, Л.В. Тумбинская, Д.В. Ребриков // Стоматология для всех. – 2011. – №1. – С.46–48.].

С целью нормировки сигнала для каждого исследуемого микроорганизма определяли величину «относительного Ct». Для этого из величины абсолютного Ct для специфического набора праймеров и зонда, усреднённого по четырем образцам одной серии, вычитали усреднённую величину Ct общей бактериальной массы для тех же образцов серии.

2.5. Методы лечения

2.5.1. Методика профессиональной гигиены полости рта

В обеих основных группах (2 и 3) комплексное лечение включало предварительные мероприятия: обучение пациентов гигиене полости рта с двухкратным контролем в течение первой недели, а затем контроль осуществляли 1 раз в неделю на протяжении двух недель. Одновременно проводили лечение кариеса, коррекцию пломб, восстановление контактных пунктов, функциональное избирательное пришлифовывание.

После обследования, регистрации исходного стоматологического статуса и фотодокументирования всем пациентам удаляли над- и поддесневые зубные отложения (Рисунок 5). Для профессиональной гигиенической обработки использовали ультразвуковой аппарат «Piezon-Master». Корневые поверхности после удаления поддесневого зубного камня сглаживали и полировали с помощью кюрет Грейси и пародонтальных боров.

Пациентам основной группы 2 проводили антимикробную обработку пародонтальных карманов с применением геля «Метрогил-Дента», а в основной группе 3 проводили антимикробную фотодинамическую терапию с использованием геля-фотосенсибилизатора «Гелеофор» и светодионого источника света АФС «Спектр» (ООО «Лазер-медцентр», Россия).

2.5.2. Методика применения геля «Метрогил-Дента»

Гель «Метрогил-Дента» («Unique Pharmaceutical Laboratories», Индия) представляет собой комбинированный противомикробный препарат, в 1 г которого содержится 10 мг метронидазола и 0,5 мг хлоргексидина биглюконата (Рисунок 6).

Рисунок 6. Гель «Метрогил-Дента» («Юник Фармасьютикал Лабораториз»).

Антимикробный спектр действия препарата «Метрогил-Дента» определяется входящими в его состав компонентами.

Метронидазол обладает антипротозойным и антибактериальным действием против анаэробных простейших и анаэробных бактерий, в том числе пародонтопатогенных видов микроорганизмов: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella denticola, Fusobacterium fusiformis, Wolinella recta, Treponema spp., Eikenella corrodens, Borrelia vincenti, Bacteroides melaninogenicus, Selenomonas spp. Механизм действия заключается во взаимодействии с ДНК микробной клетки, подавлении синтеза нуклеиновых кислот, что ведет к гибели бактерий.

Хлоргексидин – широко применяемый в пародонтологии антисептик, активный в отношении широкого спектра грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, дрожжей, дерматофитов и липофильных вирусов. В низких концентрациях, нарушая осмотическое равновесие бактериальных клеток и выход из них калия и фосфора, оказывает бактериостатическое действие; при высоких концентрациях цитоплазматическое содержимое бактериальной клетки осаждается, что ведет в конечном итоге к гибели бактерий.

Характеристики

Список файлов диссертации