Диссертация (1140612), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Опубликованные данные не позволяют количественно охарактеризовать содержание в микробиоценозе человека филы Actinobacteria: актиномицетов (пор. Actinomycetales). По наблюдениям пионеров количественного изучения состава микробиоценоза [Ximenez–Fyvie L.A. et al., 2000] актиномицеты составляют >62% всей бактериальной массы. Однако эти данные не подтверждаются результатами более поздних работ, выполненных методами глубокого секвенирования. [Jünemann S. et al., 2012] и другие авторы, использовавшие высокопроизводительные методы метагеномного анализа, установили, что доля актиномицетов в микробиоценозе составляет <5%. [Jünemann S. et al., 2012] приводит следующие показатели, характеризующие долю той или иной бактерии в микробиоценозе пародонта (в среднем в норме и при патологии): фила актиномицетов – от 1,0 до 13,5%; фила бактероидов – от 21,4 до 63,5%; фила Грам–положительных от 14,6 до 30,8%; фила фузобактерий: от 4,7 до 12,1%; фила протеобактерий: от 2,6 до 22,9%; фила спирохет: от 0,04 до 12,9%; фила Synergistetes: от 0,0004 до 0,84%.
Необходимо отметить, что данные [Jünemann S. et al., 2012] относятся к мягкому зубному налёту, тогда как другие авторы исследовали состав твёрдого зубного налета (наддесневого и поддесневого камня), состав которого может не совпадать с составом мягкого зубного налета. На показатели, определяемые методом глубокого секвенирования, влияет общий GC–состав ДНК определяемого вида, что может приводить к радикальному занижению доли в микробиоценозе таких групп, как актиномицеты и бифидобактерии. В то же время, метагеномные исследования с применением глубокого секвенирования дают возможность составить представление о составе микробиоценоза для представительных выборок, соответствующих норме и при возникновении патологии пародонта.
Анализируя процесс формирования представлений о составе микробиоценоза пародонта, целесообразно подробно остановиться на разборе публикации [Ximenez–Fyvie L.A. et al., 2000]. Её особенностью является повышенное внимание к возможной негомогенности микробиоценоза пациента в различных точках пародонта. Работая на небольшой группе из 22 здоровых лиц и 23 больных хроническим пародонтитом, [Ximenez–Fyvie L.A. et al., 2000] исследовали 2358 образцов смыва налёта с поверхности корней зубов. Это доказывает, что от каждого больного брали несколько десятков образцов. Состав микробиоценоза определяли методом дот–блот гибридизации, используя в качестве зондов полногеномную ДНК 40 типовых штаммов бактерий, меченных радиоактивным изотопом.
Авторы установили, что по показателю общей бактериальной массы в наддесневом зубном камне больные пародонтитом отличаются от здоровых лиц ~в 2 раза, что вполне достоверно для использованных при анализе групп образцов. Различия по содержанию микроорганизмов в поддесневом зубном камне составили ~5 раз. [Ximenez–Fyvie L.A. et al., 2000] сообщили о повышении доли родов Tanerella, Porphyromonas и Treponema при возникновении пародонтита.
В отличие от работы Ximenez–Fyvie L.A. et al. (2000), более ранние исследования опирались на методы классической микробиологии, преследуя цель проследить за изменениями микробиоценоза пародонта в случае возникновении пародонтита. Гингивит эти авторы рассматривали как норму, противопоставляя ее пародонтиту. Авторы перечисленных обзорных статей сделали вывод об ассоциации со здоровым пародонтом повышенной доли в микробиоценозе родов Actinomyces, Veillonella и Streptococcus. Напротив, к маркерам поражения пародонта они отнесли преобладание протеобактерий и родов Lactobacillus и Peptostreptococcus.
Наиболее значимой из современных работ, посвященных анализу микробиоценоза пародонта молекулярными методами (в том числе, ПЦР в реальном времени) является исследование Torrungruang K. et al. (2015). Акцентируя роль полимикробной биоплёнки в качестве этиологического фактора возникновения пародонтита, Torrungruang K. et al. (2015) тем не менее, преследовали цель количественно исследовать представленность в микробиоценозе пародонта пародонтопатогенов, используя в качестве инструмента молекулярный анализ в форме ПЦР в реальном времени.
Исследование Torrungruang K. et al. (2015) выполнялось в рамках государственной программы повсеместной диспансеризации всех сотрудников госкомпаний Таиланда, что обеспечило беспрецедентный размер групп и широкий географический охват населения различных регионов страны [Vathesatogkit P. et al., 2012]. Сбор материала для исследования был выполнен в течение 6 месяцев 2003 г. Молекулярному анализу методом ПЦР в реальном времени подвергалась суммарная ДНК твёрдого зубного налёта, собранного металлической кюретой с двух зубов каждого пациента, расположенных в противоположных квадрантах рта.
Для нормировки содержания бактериальной ДНК в образцах служила количественная ПЦР с использованием 16S рДНК в качестве мишени. Для специфической идентификации патогенов авторы использовали ранее описанные праймеры к уникальным участкам рДНК [Boutaga et al., 2005; Saygun I. et al., 2008; Kuboniwa M. et al., 2004]. Для калибровки чувствительности созданных тест–систем на основе ПЦР были сконструированы плазмиды, несущие фрагмент рДНК каждой бактерии, получаемый в реакции количественной ПЦР. Стандарты плазмид серийно разводили в концентрациях от 1010 до 10 копий ДНК на одно определение, проводили калибровочную реакцию ПЦР и строили кривую зависимости параметра Ct от копийности плазмиды. Выход ПЦР во всех случаях был >95% от теоретического, стандартная ошибка метода составила ~0,03 цикла. При нормировке было принято в расчет, что число рибосомных повторов в геноме T. denticola и T. forsythia равно 2, в геноме P. intermedia и P. gingivalis – 4, а в геноме A. actinomycetemcomitans – 6.
При постановке диагноза авторы руководствовались рекомендациями AAP (Академия пародонтологии США) [Page R.C., Eke P., 2007]. Представленность каждого пародонтопатогена выражалась путем распределения пациентов по его доле в микробиоценозе на 6 уровней. Категория ноль включала больных с отрицательным результатом реакции, другие пациенты включались в одну из пяти других категорий. Критическую долю патогена в микробиоценозе фиксировали в том случае, если для категории N выявлялась статистически достоверная корреляция между наличием патогена и возникновением заболевания. Для исследования влияния на риск развития заболевания пола, возраста, числа зубов, диабета и курения служил регрессионный анализ.
Torrungruang K. et al. (2015) обследовали 883 пациента основной группы и 479 лиц контрольной группы. Средний возраст основной группы оказался больше, чем контрольной. В основной группе достоверно (p<0,001) преобладали мужчины, курящие и больные диабетом. Большинство лиц контрольной группы имели в составе микробиоценоза T. forsythia (92%). Другие патогены встречались реже: T. denticola у 82%, P. intermedia – у 70%, P. gingivalis – у 62%, а A. actinomycetemcomitans – только у 26%. В основной группе абсолютное большинство пациентов >95% оказались носителями всех анализируемых патогенов помимо A. actinomycetemcomitans, которая была найдена у 50% больных. Наиболее высокое среднее содержание в микробиоценозе было показано для P. intermedia и P. gingivalis, а наименьшее – для A. actinomycetemcomitans. Встречаемость и доля в микробиоценозе оказались существенно выше для основной группы, чем в контроле для всех пяти патогенов (p<0,001).
Несмотря на стремление авторов показать склонность пародонтопатогенов к формированию комплексов и в целом очень высокую долю пациентов, инфицированных патогенами в популяции, статистически значимую склонность к коинфекции удалось обнаружить только для пары P. gingivalis и T. denticola. В основной группе корреляция была выявлена по отношению к формированию полноразмерного красного комплекса, включающего дополнительно P. intermedia.
Зависимость между содержанием в микробиоценозе исследуемых видов бактерий и возникновением заболевания изучалась методом логистической регрессии. Показано, что риск заболевания резко возрастает при одновременном накоплении в микробиоценозе всех патогенов. Однако, при исследовании T. forsythia самой по себе не была достигнута статистическая достоверность даже по первому порогу (p>0,05). С учётом этого, патоген был исключен из дальнейшего рассмотрения в рамках регрессионной модели. Из прочих патогенов P. gingivalis обнаружила самую высокую корреляцию с риском возникновения заболевания. Даже низкое содержание P. gingivalis в микробиоценозе принципиально увеличивало опасность развития поражения пародонта. При этом патогены T. denticola, A. actinomycetemcomitans и P. intermedia повышали вероятность развития заболевания лишь после превышения ими критических уровней содержания в микробиоценозе.
В настоящее время исследование Torrungruang K. et al. (2015) остается наиболее масштабным по количеству больных среди всех опубликованных работ. Это объясняется тем, что для проведения метагеномного анализа авторами был выбран метод ПЦР в реальном времени, а не глубокого секвенирования. В этом отношении работа также является единственной. Было показано, что все патогены помимо A. actinomycetemcomitans встречаются у 60% случаев вне зависимости от наличия у них хронического воспалительного поражения пародонта. A. actinomycetemcomitans обнаруживается реже: у 26% лиц со здоровым пародонтом и у половины пациентов с пародонтитом. Абсолютное содержание бактерий, окрашенных черным пигментом, на пародонте может достигать высоких значений, а абсолютный уровень A. actinomycetemcomitans всегда остается невысоким.
Выводы Torrungruang K. et al. (2015) в части патогенов красного комплекса и P. intermedia не противоречат более ранним работам по исследованию микробиоценоза пародонта у взрослого населения азиатских популяций [Papapanou et al., 1997, 2002; Kuboniwa et al., 2004]. Однако, оценка опасности A. actinomycetemcomitans в различных источниках существенно отличается. По данным ряда авторов [He et al., 2012; Kuboniwa et al., 2004; Wara–Aswapati et al., 2009], A. actinomycetemcomitans была найдена у 10–50% всего населения. В публикациях Papapanou P.N. et al. (1997, 2002) сделан вывод о наличии A. actinomycetemcomitans у 80% всего населения и более. Столь существенные различия в оценках [Christersson L.A. et al., 1992] объясняют особенностями распределения A. actinomycetemcomitans по поверхности пародонта, [Boutaga K. et al., 2005] – расхождениями в способах сбора смывов выполнения ПЦР, [Sanz M. et al., 2000] – различиями в поведении A. actinomycetemcomitans в зависимости от популяционных особенностей людей.
T. forsythia часто фигурирует среди наиболее значимых факторов, инициирующих пародонтит [Lourenco T.G. et al., 2014; Papapanou P.N. et al., 2002; Mineoka T. et al., 2008; Saygun I. et al., 2008; Papapanou P.N. et al., 1997; Laine M.L. et al., 2013]. Однако, авторы работы [Torrungruang K. et al., 2015] пришли к выводу, что в рамках их модели не удаётся выявить связь между количественной представленностью этого вида в микробиоценозе и вероятности возникновения болезни. В то же время, включив T. forsythia в модель регрессии, [Torrungruang K. et al., 2015] смогли выявить зависимость риска развития пародонтита от доли T. forsythia в микробиоценозе. Это наблюдение авторы объяснили тем, что содержание T. forsythia с микробиоценозе зависит от его насыщенности другими представителями «красного комплекса»: P. gingivalis и T. denticola [Socransky S.S. et al., 1998; Byrne S.J. et al., 2009; Mineoka T. et al., 2008]. На этом основании [Torrungruang K. et al., 2015] предположили, что для практической диагностики достаточно определять долю в микробиоценозе пародонта P. gingivalis и T. denticola, отказавшись от T. forsythia в качестве маркера заболевания. Аналогичная идея прежде высказывалась в работе [Pradhan–Palikhe P. et al., 2013], где предложен способ расчета доли T. forsythia в микробиоценозе на основании результатов определения прочих пародонтопатогенов.
Мысль о существовании критического порога колонизации пародонта патогенами, после которого происходит запуск воспалительных процессов, высказывалась рядом авторов еще на заре введения молекулярных методов в арсенал пародонтологии [Socransky S.S. et al., 1992; Boutaga K. et al., 2005]. Однако, исследование Torrungruang K. et al. (2015) стало первым, где этот тезис получил статистическое обоснование. Именно в этой работе было показано, что присутствие P. intermedia, A. actinomycetemcomitans и T. denticola в микробиоценозе статистически взаимосвязано с развитием воспалительного поражения пародонта только по достижении ими определенной доли в микробиоценозе, тогда как наличие этих бактерий в консорциуме в субкритических концентрациях не приводит к достоверному превышению вероятности запуска пародонтита. Было установлено, что пороговый уровень представленности P. intermedia и T. denticola в микробиоценозе на два порядка выше аналогичного уровня A. actinomycetemcomitans.
Этот вывод подтвержден и результатами исследований, выполненных методами классической микробиологии, а также методами гибридизации по Саузерну [Laine M.L. et al., 2013]. Таким образом, Torrungruang K. et al. (2015) доказали необходимость использования количественных подходов к оценке содержания пародонтопатогенов в микробиоценозе, и неадекватность качественных критериев требованиям практической пародонтологии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
