Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Впервые с применением методов молекулярного анализа показано, что состав поддесневой микрофлоры у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени существенно отличается от состава зубного налета пациентов со здоровым пародонтом по представленности в нём патогенов P. gingivalis, T. forsythia и T. denticola (в сторону превышения) и потенциальных пародонтопротекторов V. parvula и S. sanguinis (в сторону снижения); но не имеет достоверных отличий по представленности патогенов A. actinomycetemcomitans и P. intermedia.

Впервые установлено, что местная антибактериальная терапия в составе комплексного лечения пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней значимо снижает общую бактериальную обсеменённость поддесневого зубного налета, но практически не влияет на содержание в нём патогенной микрофлоры (P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola). Доля потенциальной протекторной микрофлоры (V. parvula) при этом достоверно возрастает, но величина прироста остается небольшой, составляя ~1 цикл относительного Ct (то есть ~ в 2 раза). Эти наблюдения объясняют краткосрочность достигаемого лечебного эффекта местной антимикробной терапии хронического пародонтита.

Впервые показано, что фотодинамическая терапия с применением фотосенсибилизатора на основе хлорина е6 (коммерческое название препарата – «Гелеофор») и светодиодного излучателя АФС «Спектр» (6 Дж/см²) приводит к достоверному снижению в составе поддесневой биопленки пародонтопатогенов A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, P. gingivalis и T. denticola, не оказывая влияния на содержание P. intermedia. Доля в консорциуме потенциальных протекторов V. parvula и S. sanguinis существенно возрастает. В отличие от традиционной антимикробной терапии эффект после ФДТ сохраняется в течение 3 мес., что соответствует кратности посещений при динамическом наблюдении пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней.

Теоретическая и практическая значимость работы

Предложена оригинальная методика молекулярного анализа в форме ПЦР в реальном времени, позволяющая проводить количественную оценку соотношения уровня представленности в поддесневом зубном налете пародонтопатогенов и пародонтопротекторов. Использование этой методики позволяет оценивать стойкость достигаемого лечебного эффекта при лечении пародонтита, отслеживая изменение соотношения видов бактерий в составе поддесневой биопленки в отдаленные сроки лечения.

Показано, что оценка представленности в микробиоме поддесневого зубного налета потенциальных пародонтопротекторов V. parvula и S. sanguinis наряду с содержанием основной группы пародонтопатогенов существенно расширяет возможности индивидуальной диагностики состояния пародонта у пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней.

С использованием разработанной методики показано, что традиционная схема лечения ХГП с применением местных антибактериальных средств не позволяет обеспечить стойкого лечебного эффекта, так как практически не влияет на соотношение численности основных патогенов и потенциальных пародонтопротекторов в составе поддесневого зубного налёта, за исключением A. actinomycetemcomitans. Однако снижение доли этого пародонтопатогена под действием антимикробных факторов достигает уровня, существенно более низкого, чем в контрольной группе пациентов без признаков поражения пародонта. Данное изменение в микробиоме требует углубленного анализа причин и следствий.

Использование курса фотодинамической терапии в комплексном лечении пациентов существенно снижает содержание в поддесневой микрофлоре наиболее часто встречающихся пародонтопатогенов: A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia и T. denticola. Одновременно наблюдается существенное увеличение доли потенциальных протекторов V. parvula и S. sanguinis. В совокупности, наблюдаемый результат фотодинамической терапии можно назвать благоприятным с точки зрения нормализации соотношения патогенной и условно патогенной микрофлоры в ПК, что снижает риск обострения хронического пародонтита.

Методология и методы исследования

Работа планировалась и выполнялась на основе принципов доказательной медицины. В исследование включались здоровые лица и пациенты с ХГП средней и тяжелой степеней обоих полов в возрасте от 35 до 67 лет. Контрольная группа 1 включала 50 человек с интактным пародонтом. Основная группа 2 включала 50 пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней, получавших комплексное пародонтологическое лечение с включением местной антибактериальной терапии препаратом «Метрогил-Дента». Основная группа 3 включала 50 пациентов, которым в составе комплексного лечения применяли фотодинамическую терапию.

Постановка диагноза и оценка эффективности лечения пациентов с ХГП осуществлялись на основе комплекса современных клинических, рентгенологических и молекулярно–генетических методов исследования, в том числе, с применением анализа состава поддесневой микрофлоры методом ПЦР в реальном времени. Для обработки результатов проводилось усреднение всех показателей по группам, после чего группы сравнивались статистическими методами.

Наряду с клиническим стоматологическим обследованием у каждого пациента с помощью эндодонтических адсорберов отбирали по четыре образца поддесневого содержимого (два образца с верхней челюсти и два – с нижней челюсти с каждой стороны). У пациентов контрольной группы образцы поддесневой микрофлоры отбирали однократно, у пациентов основных групп – непосредственно до начала лечения, через 30 и 90 дней после его окончания.

Из полученных образцов выделяли суммарную ДНК, которую анализировали на содержание общей бактериальной ДНК, пяти пародонтопатогенов (P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia) и двух кандидатных пародонтопротекторов (V. parvula и S. sanguinis) с применением ПЦР в реальном времени в формате Taqman. Флуоресцентный сигнал, полученный при исследовании каждого конкретного бактериального вида, нормировали на сигнал общей бактериальной массы (16S рДНК), получая, таким образом, показатель, характеризующий долю бактерии в составе исследуемого микробиома – относительный Ct. Эти показатели использовались для усреднения по группам, после чего проводили оценку достоверности различия между группами методом непараметрического анализа по Манна–Уитни.

Научные положения, выносимые на защиту

1. С применением методов молекулярно-генетического анализа на основе ПЦР в реальном времени показано существенно более низкое содержание потенциальных пародонтопротекторов V. parvula и S. sanguinis у пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней по сравнению с группой лиц с интактным пародонтом. Таким образом, получены доказательства возможности использования относительного содержания V. parvula и S. sanguinis в качестве молекулярных маркеров для оценки состояния тканей пародонта.

2. Комплексная консервативная терапия с местным применением антимикробного препарата «Метрогил-Дента» эффективна для лечения пациентов с ХГП с высокой обсеменённостью пародонта A. actinomycetemcomitans, но менее эффективна в снижении относительной обсеменённости пародонта другими пародонтопатогенами: P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticolа. Данный вид лечения, как правило, приводит к снижению доли в поддесневом микробиоме потенциальных протекторов V. parvula и S. sanguinis.

3. Фотодинамическая терапия с применением препарата «Гелеофор» эффективна для снижения обсеменённости пародонта A. actinomycetemcomitans, T. forsythia P. gingivalis и T. denticolа. По сравнению с традиционной антимикробной обработкой ПК, ФДТ положительно влияет на содержание в поддесневом микробиоме потенциальных пародонтопротекторов V. parvula и S. sanguinis.

Внедрение результатов исследования

Основные результаты диссертационной работы внедрены в процесс преподавания ординаторам, врачам-стоматологам на курсах повышения квалификации на кафедре Стоматологии ИПО ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России. Метод молекулярного анализа в форме ПЦР в реальном времени применительно к исследованию поддесневого микробиома внедрен в качестве вспомогательного средства диагностики в отделении терапевтической стоматологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России.

Личный вклад автора в выполнение работы

Диссертантом лично выполнены все необходимые мероприятия по планированию, подготовке и осуществлению исследования: проведен сбор и анализ публикаций по теме; выполнен отбор участников исследования в соответствии с критериями включения; проведено клиническое стоматологическое обследование 150 человек (50 лиц со здоровым пародонтом и 100 пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней) с индексной оценкой состояния тканей пародонта; выполнено комплексное консервативное лечение 100 пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней, в том числе 50 человек – с включением местной антибактериальной терапии и 50 человек – с применением фотодинамической терапии; отобрано и исследовано методом ПЦР в реальном времени 1400 образцов поддесневой микрофлоры; сформированы базы полученных данных в электронном виде и проведена их статистическая обработка с применением непараметрических методов; выполнен анализ полученных результатов; подготовлены тексты диссертации и публикаций; представлены результаты работы в виде докладов на международных и всероссийских конференциях.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 141 странице машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, обсуждения результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы содержит 266 источников, из них 96 отечественных и 170 зарубежных авторов. Диссертационная работа содержит 17 таблиц и иллюстрирована 18 рисунками.

Диссертационная работа выполнена на кафедре Стоматологии ИПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова в соответствии с планом научной работы и в отделении терапевтической стоматологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности выводов определяется участием в исследовании необходимого количества пациентов всех групп (в общей сложности – 150 человек), сбалансированностью половозрастных характеристик контрольной и основных групп, использованием современных диагностических методов. При проведении молекулярного анализа для определения общей бактериальной массы образца и пяти пародонтопатогенов методом ПЦР в реальном времени использован коммерчески доступный сертифицированный набор «Дентофлор». Для выявления потенциальных пародонтопротекторов V. parvula и S. sanguinis использован оригинальный комплект реагентов, разработанный при участии диссертанта. При анализе градуально изменяющихся переменных (относительные Ct) применялись адекватные методы статистической обработки данных: непараметрический критерий Манна–Уитни. Добровольность вовлечения пациентов в исследование подтверждена их письменным информированным согласием.

Результаты исследования доложены на научно–практических конференциях: XVI Форум «Стоматология 2014» (Москва, 2014); VIII Ежегодный научный форум «Стоматология 2016» (Москва, 2016); VII научно-практической конференции молодых ученых (Москва, 2016); Общероссийской конференции «Новое в этиологии, патогенезе и совершенствовании способов профилактики и лечения стоматологических заболеваний» (г. Тверь 17 – 18 ноября 2016).

Апробация диссертационной работы состоялась «04» июля 2017 г. на совместном заседании сотрудников кафедры Стоматологии ИПО ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, отделения терапевтической стоматологии, отделения эндодонтии и кариесологии, отделения профилактики стоматологических заболеваний ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 8 – в журналах, рекомендованных ВАК для защиты по специальности «Стоматология».

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Исследование состава микробного консорциума пародонта человека методами молекулярного анализа

Ротовая полость является открытой экологической системой, постоянно находящейся под воздействием различных внешних факторов. Они могут влиять на динамику состава микробиома, в том числе, осложнять лечение инфекции. Взаимодействие между организмом человека и населяющими его комменсальными, условно–патогенными и патогенными видами бактерий либо обеспечивает поддержание здоровья органов и тканей полости рта – симбиоз, либо запускает развитие воспалительного поражения пародонта – дисбактериоз [Зеленова Е.Г. с соавт., 2004; Зорина О.А. с соавт., 2014; Hajishengallis G. et al., 2012; Yost S. et al., 2015].

В работе Socransky S.S. et al. (1994), посвященной характеристике микробиоценоза пародонта в норме и при воспалительных заболеваниях, впервые предложено понятие «цветных комплексов» бактерий и высказан тезис о ключевой роли пяти бактериальных патогенов в развитии пародонтита. В таксономической иерархии, три основных пародонтопатогена T. forsythia, P. gingivalis и P. intermedia принадлежат типу Bacteroidetes, причем виды T. forsythia и P. gingivalis таксономически близки, относясь к одному и тому же семейству Porphyromonadaceae. бактерий T. forsythia и P. gingivalis – отнесены авторами к красному комплексу, а P. intermedia – к оранжевому. T. denticola (фила Spirochaetes) не родственна T. forsythia и P. gingivalis, но образует наряду с ними красный комплекс. Членом оранжевого комплекса помимо P. intermedia оказалась A. actinomycetemcomitans (фила Proteobacteria). Из сказанного ясно, что объединение пародонтопатогенов в комплексы по Socransky S.S. et al. (1994) имеет смысл исключительно с точки зрения патологии человека, но не с точки зрения систематики бактерий.

Характеризуя состав микробиоценоза пародонта, целесообразно отметить, что в нём преобладают представители фил Firmicutes и Fusobacteria, среди которых нет ярко выраженных пародонтопатогенов. К филе Грам–положительные (Firmicutes) относятся порядки Clostridiales, Lactobacillales и Selenomonadales. Непатогенную или малопатогенную для пародонта группировку внутри филы Proteobacteria составляет массово представленный в микробиоценозе порядок Neisseriales. Примером экзотической и слабо изученной филы является Synergistetes, представленный единственным видом. Однако, несмотря на низкую долю в микробиоценозе, эта фила присутствует практически у каждого человека, причём её доля возрастает при возникновении воспалительного процесса [Зорина О.А. с соавт., 2014; Torrungruang K. et al., 2015].

Характеристики

Список файлов диссертации