Диссертация (1139719), страница 57
Текст из файла (страница 57)
3.2.4). Результаты показали,в сумме комплекса ДВ листьев крапивы двудомной около половины приходится на данныеБАВ (рис. 160).0,5785(галловаякислота)0,7243(танин)Доля танина и галловой кислоты в комплексеДВлистьев КД, % (в пересчете на абсолютносухое вещество)Рис. 160. Доля танина и галловой кислоты в сумме комплекса ДВ листьев крапивы двудомной300При проведении валидационных исследований были установлены такие характеристикиразработанной методики, как предел определения (ПО), линейность и воспроизводимость. Содержание суммы ДВ в пересчете на танин в образцах ЛPC составило 2,6023±0,06954% (принятое опорное значение).Линейность определяли на семи уровнях концентраций.
Критерий приемлимости - коэффициент корреляции не менее 0,995 (рис. 161).Оптическая плотность1,4y = 0,0572x - 0,0462R² = 0,99931,210,80,60,40,2013579111315171921Содержание суммы ДВ в пересчете на танин в извлечении,г/мл ×10-623Рис. 161. Линейная зависимость оптической плотности раствора от содержания суммы ДВ в извлеченииВоспроизводимость методики определяли в условиях, при которых не менее шести независимых результатов измерений получали одним и тем же методом с использованием спектрофотометра Hitachi U-1900 (Япония) [21]. Результаты, полученные при статистической обработке, достоверны при доверительной вероятности 95%, вычисленное значение RSD – 1,04% и относительного доверительного интервала среднего значения – 2,706% не превышают критериевприемлемости - 5%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости(таблица 196).
Другие характеристики линейности (наклон прямой, отрезок на оси ординат)приведены в таблице 196.Таблица 196Результаты валидации методики количественного спектрофотометрическогоопределения ДВ в листьях крапивы двудомной [303]Статистические характеристикиРезультаты12Оценка линейности методикиУравнение регрессииу=0,0572х-0,04622R0,9993Диапазон линейности (грамм БАВ в пересчете на танин1,879 – 22,551×10-6в 1 мл раствора)Оценка прецизионности методики по показателю сходимостьпробаОптическая плотностьСодержание АЦ, %30111234560,3960,3950,3930,4030,4020,395Минимальное значение, %Максимальное значение, %Среднее значение, %Значение доверительного интервала (Р=95%), %SD, %RSD, %Предел определения, гКоличество грамм БАВ в пересчете на танин в 1 млраствора22,593572,587022,573922,639422,632872,587022,573922,639422,602302,6023±0,069542,7061,041,879×10-6Согласно полученным результатам, разработанная методика валидна и пригодна для использования в целях стандартизации данного ЛРС.Таким образом, наиболее предпочтительным для количественного определения суммыДВ в листьях оказался метод спектрофотометрии, в основе которого лежит измерение оптической плотности спирто-водной вытяжки из ЛPC при длине волны 277±2 нм, так как средняяошибка определения составляла около 3 %, что в 3-5 раз меньше ошибки при использованиидругих методов.
Поэтому для включения в НД могут быть рекомендованы методы перманганатометрии для определения суммы окисляемых полифенольных соединений и спектрофотометрии для определения суммы ДВ в пересчете на танин в листьях крапивы двудомной.6.2.4. Определение суммы свободных аминокислот в листьях крапивыАК вносят существенный вклад в фармакологическое действие растений. Поэтому изучение качественного и количественного состава АК в ЛРС имеет практическое значение и вызывает научный интерес.В литературе представлены сведения по определению суммы АК в пересчете на аспарагиновую кислоту в надземной части и сухом экстракте крапивы коноплевой [99,206,264]. Так,например, суммарное содержание свободных АК в различных образцах сырья крапивы двудомной и крапивы жгучей составляет от 10,8 до 68,9 мкг/мг, содержание связанных АК – от 15,3 до154,1 мкг/мг [141].Предварительное качественное обнаружение АК проводили по реакции со спиртовымраствором нингидрина.
Появление фиолетового окрашивания в извлечении из исследуемогоЛРС указывало на наличие АК [251]. Методом ТСХ с применением простого и двумерного302элюирования (Глава 4, п. 4.4.1 и 4.4.2) в извлечении из листьев КД проведена идентификациясвободных АК в сравнении с достоверными стандартными образцами [119,120].Для количественного определения АК в листьях крапивы двудомной была использованаунифицированная методика, разработанная и запатентованная учеными из Перми (Т.И. Ярыгина с соавторами), с применением спектрофотометрии в видимой области [195,227].
Спектрыпоглощения продуктов реакции извлечения (комплекса АК) из исследуемого ЛРС, полученныхпри pH 6,4 с нингидрином, характеризуются тремя четко выраженными максимумами поглощения при длинах волн 276±2 нм; 401±2 нм и 568±2 нм, а также 2 минимумами, лежащим в области 350-360 нм и 460-480 нм. В качестве аналитической используется длина волны 568 нм.Максимумы поглощения продукта реакции глутаминовой кислоты с нингидрином находятся вобласти 276±2 нм; 401±2 нм; 568±3 нм, что позволяет рекомендовать глутаминовую кислоту вкачестве стандартного образца в расчетах содержания суммы свободных АК в сырье крапивыдвудомной (рис.
162). Установлено, что оптическая плотность продуктов реакции выделеннойсуммы АК извлечения из листьев крапивы двудомной с нингидрином достаточно стабильна,незначительно снижаясь к 60 минуте наблюдения.Показано, что максимальное извлечение АК достигается при использовании фракции сырья с размером частиц 2,0-1,0 мм (рис. 163). Оптимальным соотношением сырья и экстрагентапризнано 1:50 (таблица 197).Рис. 162. Спектры поглощения (1 – 0,025% водного раствора глутаминовой кислоты; 2 продукта реакции глутаминовой кислоты с нингидрином; 3 - продуктов реакции водного извлечения с нингидрином)Таблица 197Влияние соотношения сырья и экстрагента на извлечение АК из листьев крапивы двудомной[311]№ п/пЛРС:экстрагентНайдено АК, %11:101,728±0,0175921:254,696±0,0478131:505,518±0,0561941:704,610±0,0469351:1004,790±0,04876303Рис.
163. Влияние степени измельченности ЛРС на выход АК в извлечениеПовышение кратности сначала приводит к повышению экстрагируемости АК, а затем сопровождается снижением данного показателя по сравнению с однократной экстракцией.
Повидимому, это связано со снижением времени контакта сырья с растворителем при увеличениикратности экстракции до трех (рис. 164).Экстракцию следует проводить при температуре кипения водяной бани, что сопровождается максимальным выходом АК в водное извлечение (рис. 165). Максимальный выход суммысвободных АК в извлечение, согласно экспериментальным данным, наблюдается к 30 минутеэкстракции и сохраняется постоянным (в пределах ошибки определения) до 60 минут (рис. 166).Рис.
164. Влияние кратности экстракции на выход АК в извлечение304Рис. 165. Влияние температуры экстракции на выход АК в извлечениеРис. 166. Влияние времени экстракции на содержание АК в извлеченииКоличественное определение. Около 2,0 г (т.н.); степень измельчения: от 1,0 до 2,0 мм;двукратная экстракция при соотношении ЛРС и экстрагента 1:25, время каждой экстракции – 15минут; объем аликвоты извлечения - 1 мл.
Параллельно проводили аналогичные опыты с 2 мл0,025% раствора рабочего стандартного образца глутаминовой кислоты и 2 мл воды очищенной(контрольный опыт). Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре Hitachi U-1900 (Япония) при длине волны 568 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно контрольного опыта.
Содержание суммы свободных АК в пересчете на кислоту глутаминовую и на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле 33:Х ,%Ах 0,025 Vk 100 100 100 2Ах 0,025 Vk 200A0 m 1 100 100 (100 W )А0 m (100 W )(33)где А — оптическая плотность испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора РСОглутаминовой кислоты; m — масса сырья, г; Vk – объем объединенного извлечения из ЛРС после двукратной экстракции; W — потеря в массе при высушивании сырья, %.305Метрологическая оценка результатов количественного определения суммы свободныхАК в листьях крапивы двудомной показала, что средняя ошибка с доверительной вероятностью95% составила 1,02%, а ошибка единичного определения – 2,49% (таблица 198).Таблица 198Метрологическая оценка результатов количественного определения суммы свободных АК влистьях крапивы двудомной2xсрSSSxcpSr,%∆x∆xcpεср, % ε, %5,5183 0,002868 0,05355 0,021870,970,1376 0,056191,022,49Валидация разработанной методики проведена по следующим показателям: предел определения, линейность, специфичность, правильность и сходимость.
Принятое опорное значениесодержания суммы АК в пересчете на кислоту глутаминовую в образцах ЛРС составило 5,5183±0,05619%.Специфичность определяли методом добавок. Данные рис. 167, показывают, что добавление РСО кислоты глутаминовой, спектр поглощения продуктов реакции извлечения из ЛРС снингидрином имеет сходный вид с характерными максимумами поглощения при 280±2; 401±2и 568±2 нм.Рис. 167. Графическое изображение зависимости величины оптической плотности продуктовреакции с нингидрином извлечения из листьев крапивы двудомной (1 – без добавки РСО кислоты глутаминовой: 2 – с добавкой РСО кислоты глутаминовой)Правильность методики устанавливали методом «введено – найдено».
Средний процентвосстановления должен находиться в пределах 100±5% [21,22,107]. В разработанной методикеданный показатель составил 103,05% (таблица 199), что соответствует рекомендуемому критерию приемлемости.Линейность определяли на семи уровнях концентраций. Растворы готовили путем увеличения аликвоты по следующей схеме: аликвота раствора А от 0,10 до 1,50 мл – объем раствораБ 100,0 мл (10,0 - 150,0%). Критерий приемлимости – коэффициент корреляции не менее 0,995306(рис. 168).
Другие характеристики линейности (наклон прямой, отрезок на оси ординат) приведены в таблице 200.№п/п123456Таблица 199Определение правильности методики (результаты опытов с добавками) [311]ДобавленоИсходное значениеОжидаемое ПолученноеСредняяРСО кислотысуммы АК в извлечесодержание, содержание,ошибка,глутаминонии, ггг%вой, г0,00006250,0006220,00062980,00006250,0006220,00062980,00006250,0006220,00057090,0005595103,050,0001250,00068450,00075950,0001250,00068450,000726640,0001250,00068450,00073183Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
