Диссертация (1139719), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Для получениянаиболее стабильных результатов, в качестве комплексообразующего реагента является оптимальным использование 2 % спиртового раствора хлорида алюминия в соотношении экстракткомплексообразователь 1:2 (рис. 147 и таблица 185).Рис. 147. Влияние концентрации комплексообразователя на результаты определения флавоноидов в извлеченииТаблица 185Влияние соотношения объема извлечения из листьев крапивы двудомной и комплексообразователя на содержание флавоноидов [305]№Соотношение извлечения и комСодержание флавоноидов, %п/пплексообразователя11:11,671±0,03621:22,021±0,04431:51,695±0,037Полноту экстракции флавоноидов из ЛРС устанавливали, варьируя такими параметрами,как степень измельченности сырья (рис. 148), полярность экстрагента (рис. 149), соотношениесырья и экстрагента и временя экстракции (рис. 150).286Рис.
148. Влияние степени измельченности ЛРС на выход флавоноидов в извлечениеВыявлено, что максимальное извлечение флавоноидов достигается при использованиисырья с размером частиц менее 0,2 мм. Лучшим экстрагентом для выделения флавоноидовявляется 96 % этанол при соотношении сырья и экстрагента 1:50 (таблицы 186 и 187).Рис. 149. Влияние полярности экстрагента на извлечение флавоноидов из листьев крапивы двудомнойТаблица 186Влияние экстрагента на извлечение флавоноидов из листьев крапивы двудомной [305]№ЭкстрагентРМаксимумНайдено флаФлавоноид [133]п/пвоноидов,%поглощения,нм1Гексан02Гексан-96% эта2,603991,867±0,04103-метилкемпферолнол (1:1)411рутин396% этанол5,201,885±0,0413470% этанол6,344021,323±0,0290кверцетрин540% этанол7,484050,382±0,00806Вода9,00«-» при использовании экстрагента флавоноиды не извлекались.гиперозид-На следующем этапе оценивали влияния полярности экстрагента на выход флавоноидов(рис. 149).
Установлено, что неполярные растворители не способны извлекать данные БАВ изЛРС. Увеличение полярности до 2,5 единиц приводит к повышению экстрагируемости флавоноидов, сохраняющееся до 5,5 единиц. Дальнeйшее увeличение полярности экстрагeнтанeцелeсообразно, ввиду снижения содeржания флавоноидов в извлeчeнии (рис. 149). Величина287полярности влияет не только на суммарный выход флавоноидов из ЛРС, но и на их качественный состав в извлечении.
Экспериментальные данные показали, что максимум поглощениякомплекса флавоноидов извлечения с раствором алюминия хлорида при варьировании полярностью экстрагента, находится при разных длинах волн (таблица 186). Вероятнее всего, этоможно обьяснить влиянием полярности растворителя на преиммущественный выход того илииного флавоноида в извлечение. Наилучшее время экстракции, согласно полученным результатам, составило 45 минут (рис.
150).Рис. 150. Влияние времени экстракции на содержание флавоноидов и извлеченииТаблица 187Влияние соотношения сырья и экстрагента на извлечение флавоноидов из листьев крапивыдвудомной [302]№ЛРС:ЭкстрагентНайдено флавоноидов, %п/п11:301,328±0,02921:502,827±0,06231:701,671±0,037Количественное определение. Около 1 г ЛРС (т.н.), измельченного до размера частиц менее 0,2мм экстрагируют в конической колбе объемом 100 мл на кипящей водяной бане с обратным холодильником с 50 мл 96% этанола в течение 45 мин, предварительно взвешивая с точностью±0,01 г. Содержимое колбы после охлаждения и взвешивания, фильтруют через бумажныйфильтр, отбрасывая первые порции фильтрата (раствор А).
2 мл извлечения переносят в мернуюколбу объемом 25 мл, добавляют 4 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% этаноле и 4 каплиразведеной уксусной кислоты. Доводят объем раствора 96% спиртом до метки (раствор Б) иоставляют на 15 мин. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре Hitachi U-1900 (Япония) в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 410±2 нм.Раствор сравнения: 2 мл извлечения, 4 капли разведеной уксусной кислоты и 96% этанол, добавленный до метки в мерной колбе объемом 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО рутина, обработанного аналогично испытуемому раствору (Глава 2, п.
2.7).288Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах(X) вычисляют по формуле 31:Х ,%Ах 0,025 50 25 100 100A0 m 2 50 25 (100 W )Ах 0,025 5000А0 m (100 W )(31)А — оптическая плотность испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора РСО рутина; m — масса сырья, г; W — потеря в массе при высушивании сырья, %.Метрологическая оценка разработанной методики показала, что относительная ошибка сдоверительной вероятностью 95% составляет около 5%, т.е. находится в пределах случайнойошибки предложенной методики (таблица 188).Таблица 188xср1,5519Метрологическая оценка метода анализа (P = 95 %; n = 6)S2SSxcpSr,%∆x∆xcpεср, %0,00105 0,0324 0,0132 2,09 0,083 0,034 2,19ε, %5,37Валидация разработанной методики осуществлялась по таким параметам, как специфичность, линейность, правильность, предел определения и сходимость.
Содержание флавоноидовв пересчете на рутин в образцах ЛРС, принятое в качестве опорного значения, составило1,5519±0,034%.Специфичность методики устанавливали методом добавок. При введении РСО рутина визвлечение, его дифференциальный спектр имеет аналогичный вид с характерными максимумами поглощения при 224±2; 270±2 и 410±2 нм (рис. 151).Правильность методики определяли путем расчета количественного содержания суммыфлавоноидов в пересчете на рутин в растворах, полученных после добавления необходимогоколичества стандарта к исследуемому раствору до концентраций 125; 131,25; 162,5; 225%. Критерием приемлемости является величина среднего процента восстановления в пределах100±5%.
В разработанной методике средний процент восстановления составил 98,19% (таблица189).Рис. 151. Вид дифференциального спектра поглощения извлечения из листьев крапивы двудомной (ряд 1 – без добавки РСО рутина: ряд 2 – с добавкой РСО рутина)289Линейность методики определяли на пяти уровнях концентраций. Растворы готовилипутем увеличения аликвоты извлечения по схеме: аликвота раствора А от 0,75 до 3,0 мл – объемраствора Б 25,0 (37,5 – 150,0%). Критерий приемлимости – коэффициент корреляции не менее0,995 (рис.
152). Наклон прямой, отрезок на оси ординат и другие характеристики линейностиприведены в таблице 190.№п/п1234567Таблица 189Определение правильности методики (результаты опытов с добавками) [305]Найдено суммы флаво- ДобавленоДолжноСредний проНайдено руноидов в пересчете на РСО рубыть рутицент восстатина, грутин, гтина, гна, гновления, %0,001000,001800,002200,000500,001300,001200,000500,001300,001100,000800,000250,001050,0012698,190,000250,001050,000910,000200,001000,000910,000200,001000,00091Результаты оценки методики по показателю сходимость, обработанные статистически,достоверны при доверительной вероятности 95%. Рассчитанные значения RSD – 2,09% и относительного доверительного интервала среднего значения – 2,19% не превышают критериевприемлемости - 5%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости(таблица 190).Рис.
152. Зависимость оптической плотности раствора от объема исследуемого извлеченияРазработанная методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов впересчёте на рутин в листьях крапивы двудомной, согласно полученным результатам, валиднаи пригодна для использования в целях стандартизации и оценки качества данного ЛРС.290Таблица 190Результаты валидационной оценки методики спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в листьях крапивы двудомной [305]Статистические характеристикиРезультатыОценка линейности методикиУравнение регрессииу=0,0747х-0,029R20,9969Диапазон линейности (грамм БАВ в 1 мл3,1 – 9,3×10-4раствора)Оценка прецизионности методики по показателю сходимостьпробаОптическая плотность123456Найдено флаваноидов, %0,3030,2960,3020,2910,3040,290Минимальное значение, %Максимальное значение, %Среднее значение, %Значение доверительного интервала(Р=95%), %SD, %RSD, %Предел определения, гКоличество грамм БАВ в 1 мл раствора1,57971,54321,57451,51721,58491,51191,51191,58491,55191,5519±0,0341,5179 – 1,58593,242,092,33×10-4Для более достоверной оценки результатов количественного определения суммы флавоноидов и ГКК малоселективными скрининговыми спектрофотометрическими методами былопроведено детальное изучение профиля данных групп БАВ.
Идентификация индивидуальныхфлавоноидов и производных ГКК основывалась на хроматографической подвижности, УФ- имасс-спектрах, путем сравнения с имеющимися стандартами. Содержание данных групп БАВопределяли методом абсолютной калибровки.По результатам ВЭЖХ-ДМД-МС флавоноиды в изучаемом образце листьев крапивыдвудомной представлены гликозидами кверцетина, кемпферола и изорамнетина, среди которыхпреобладал рутин (50,9% от суммы флавоноидов). Идентифицированы также изорамнетин-3-Орутинозид или нарциссин (25,2%), изокверцитрин (17,1%) и кемпферол-3-О-рутинозид или никотифлорин (6,8%). Коэффициенты емкости (К), аналитические массы m/z, максимумы поглощения (λmax, нм) и содержание флавоноидов в листьях крапивы двудомной представлены в таблице 191.
ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из листьев крапивы двудомной представлена нарис. 153.291Рис. 153. ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из листьев крапивы двудомной при λ=350 нм. 1 –рутин, 2 – изокверцитрин, 3 – никотифлорин, 4 – нарциссинТаблица 191Результаты ВЭЖХ-ДМД-МС флавоноидов в листьях крапивы двудомной№ ФлавоноидКESI-MS+,Детектируемый ионλmax,Содержние,п/пm/zнммг/г1Рутин4,50611.21,[M+H]+256,0,67465.15,[M – рамноза** + Н]+266,303.09[M – рутиноза + Н]+356+2 Изокверцит- 4,86465.15,[M+H]254,0,22рин303.09[M – глюкоза + Н]+266,3563Никоти4,99595.22[M+H]+266,0,09+флорин449.15,[M – рамноза + Н]346287.09[M – рутиноза + Н]+4Нарциссин 5,06625.23,[M+H]+254,0,33479.17[M – рамноза + Н]+266317.10[M – рутиноза + Н]+356Сумма флавоноидов1,31**Остаток моно и/или дисахарида, представляющий собой молекулярную массу минус 18 Да(молекула воды, теряющаяся при образовании гликозидной связи).ВЭЖХ-ДМД-МС анализ водно-метанольного извлечения из листьев крапивы показалприсутствие 13 производных ГКК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
