Диссертация (1139719), страница 56
Текст из файла (страница 56)
Следует отметить, что основной ГКК была установлена нехлорогеновая кислота (18,2 от суммы производных ГКК %), а 2-кофеоиляблочная кислота(37,2%). Обнаружено также существенное количество розмариновой кислоты (10,2%). Коэффициенты емкости, аналитические массы m/z, максимумы поглощения (λmax, нм) и содержаниепроизводных ГКК крапивы представлены в таблице 192.ВЭЖХ извлечения из листьев крапивы двудомной показана на рис. 154. Спектр поглощения 2-кофеоиляблочной кислоты изображен на рис.
155.292Рис. 155. Спектр поглощения 2-кофеоиляблочной кислотыРис. 154. ВЭЖХ-хроматограмма извлечения из листьев крапивы двудомной при λ=330 нм. Номера пиков производных ГКК на хроматограмме соответствуют номерам в таблице 192Среди минорных производных ГКК были идентифицированы изомеры кофеоилхинныхкислот (неохлорогеновая, криптохлорогеновая кислоты), кафтаровая, кофейная и п-кумароваякислоты. Полученные нами данные о профиле флавоноидов и производных ГКК в листьях исследуемых образцов крапивы двудомной схожи с литературными данными о крапиве того жевида, заготовленной в странах Европы. Так, в надземной части культивируемой крапивы, собранной в Дании, основными флавоноидами (в порядке уменьшения содержания) были рутин иизокверцитрин, а основными производными ГКК (в порядке уменьшения содержания) – 2кофеоиляблочная и хлорогеновая кислоты, как и в листьях крапивы, заготовленной в Италии[404,416].293Таблица 192ВЭЖХ-ДМД-МС прозводных ГКК в листьях крапивы двудомной№Производное ГККК*112Кофеоилхинная кислота32,412Неохлорогеновая кислота2,563Кафтаровая кислота2,734Хлорогеновая кислота3,125КриптохлорогеноваякислотаКофейная кислота3,2072-кофеоиляблочнаякислота4,168п-кумаровая кислота5,079Производное феруловой кислоты5,3363,96ESI-MS+,m/z4355.14,163.07355.14,163.07313.09,163.07355.14,163.07355.14,163.07181.08163.07615.14,314.13,297.10,279.09,163.07,135.07165.08,147.07119.07609.24,449.16,357.28,197.15,177.08Детектируемый ионλmax, нм5[M+H]+[M – хинная кислота** + Н]+[M+H]+[M – хинная кислота + Н]+[M+H]+[M – винная кислота + Н]+[M+H]+[M – хинная кислота + Н]+[M+H]+[M – хинная кислота + Н]+[M+H]+[M – вода + Н]+[2M+Na]+[M+NH4]+[M+H]+[M – вода +H]+[M – яблочная кислота +H]+[M – яблочная кислота – СО +H]+[M+H]+[M – вода +H]+[M – СО +H]+6218, 234, 300плечо, 325218, 234, 300плечо, 326216, 242, 295плечо, 328218, 234, 300плечо, 326218, 234, 300плечо, 325226 плечо, 238, 310плечо, 324218, 242, 300плечо, 328[феруловая кислота +H]+Содержание,мг/г70,220,230,681,820,280,333,72210, 226, 292плечо, 3100,47214, 234, 298 плечо,3300,19294110.2Розмариновая кислота35,934567378.16,[M+NH4]+218, 235 плечо, 2471,02361.13,[M+H]+плечо, 290 плечо,343.12,[M – вода +H]+330+197.15,[М – кофейная кислота]163.07,[кофейная кислота +H]+135.07[кофейная кислота – СО +H]+11.
Неидентифицированное произ6,77533.32,[M+H]+202 плечо, 244, 2950,28водное кофейной кислоты309.25,плечо, 226195.10,163.07[кофейная кислота +H]+12. Неидентифицированное произ9,95767.30,[2M+Na]+214, 236, 300 плечо,0,26водное ГКК373.17[M+H]+33013. Неидентифицированное произ10,24345.14,[M+H]+212, 244, 254, 2800,52водное ГКК181.15плечо, 324Сумма производных ГКК10,02*Коэффициент емкости; **Остаток кислоты, представляющий собой молекулярную массу минус 18 Да (молекула воды, теряющаясяпри образовании сложноэфирной связи)2956.2.3. Определение дубильных веществ в листьях крапивы двудомнойАнализ литературы за последние 20 лет, показал, что большая часть публикаций по количественному определению ДВ в ЛРС посвящена методу перманганатометрии [91,93,97,98,242].
Метод перманганатометрического титрования, включенный в ГФ Х, ХI и XIII изданий – метод Левенталя, изменённый А.Л. Курсановым, основан на способности ДВ быстроокисляться в сильно разбавленном кислом растворе в присутствии индикатора – индигосульфокислоты. Метод показал сравнительно хорошую воспроизводимость. Однако, некоторая завышенность результатов определений обусловлена: субъективностью определения конца титрования по появлению золотисто-желтой окраски; сильной зависимостью результатов от интенсивности перемешивания титруемого раствора и освещения; зависимостью расхода перманганатакалия от скорости титрования; неприемлемостью применения единого пересчетного коэффициента для растительного сырья, содержащего танино-катехиновую смесь (показано, что в зависимости от исследуемых объектов он может составлять от 0,00416 до 0,00735).
Физикохимические методы в настоящее время все чаще включают в современную НД. Широко применяются методы спектрофотометрии, как прямой, так и дифференциальной, основанные на образовании окрашенных комплексов ДВ с различными цветореагентами [17,194]. Метод потенциметрического титрования позволяет не только оценить количественное содержание суммы ДВ вЛРС, но и дифференцировать конденсированные и гидролизуемые группы танинов [213,256].Применение спектрофотометрического и потенциометрического методов выявило наибольшуюсходимость результатов определения ДВ, причем с наименьшей погрешностью.
Среди хроматографических методов, ВЭЖХ позволяет установить качественный и количественный состав отдельных компонентов [97,98,211,416,417]. Встречаютсяпубликации, посвященные количе-ственному определению галловой кислоты методом ТСХ с применением специализированногопрограммного обеспечения [372].Предварительное количественное определение суммы ДВ по методу ГФ ХIII в листьяхкрапивы двудомной, показало значительное их содержание.
Кровоостанавливающий эффектнастоя данного ЛРС может быть обусловлен суммой полифенольных соединений (флавоноидов, ГКК и ДВ), так как витамин К не извлекается водой, являясь ЖРВ.Для извлечения суммы ДВ из ЛРС, согласно литературным данным [97,98,198,234],наиболее часто используют воду в качестве экстрагента.
Экспериментальным путем установлено, что оптимальным соотношением ЛРС и экстрагента для извлечения ДВ является 1:125 (таблица 193), а наилучшее время экстракции, за которое будет извлекаться максимальное количество БАВ данной группы, составляет 30 минут (рис. 156).296Таблица 193Влияние соотношения сырья и экстрагента на извлечение ДВ из листьев крапивы двудомной[303]№ п/пЛРС:экстрагентНайдено ДВ, %11:1007,3321:1259,2631:1506,7941:2005,2351:2504,61Содержание БАВ, %10987615202530354045Время экстракции, минРис. 156.
Влияние времени экстракции на извлечение ДВ из листьев крапивы двудомнойМаксимальное содержание БАВ в извлечении наблюдается при использовании частицсырья, проходящего через сито с размером отверстий 0,5 мм и меньше (рис. 157). В стандартной методике ГФ XIII указано, что извлечение фильтруют после охлаждения. Однако, согласноправилам изготовления извлечений из ЛРС, содержащего БАВ различных групп, при выделении ДВ фильтрование проводят в горячем виде. ДВ растворимы в горячей и мало в холоднойводе, что может привести к выпадению их в осадок. Было проведено сравнение содержания ДВв извлечении при фильтровании в горячем виде и после полного охлаждения (рис. 158).
Данныепоказывают, что фильтрование извлечения необходимо проводить в горячем виде.Содержание БАВ, %109,269,258,997,47864200,20,51Размер частиц, мм2Рис. 157. Содержание ДВ в извлечении в зависимости от размера частиц297Получение извлечения: Около 1,0 г (т.н.) измельченного ЛРС с размером частиц менее 0,5мм экстрагируют в конической колбе объемом 250 мл с 125 мл нагретой до кипения воды наводяной бане с обратным воздушным холодильником в течение 30 мин.
Жидкость процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу, не дожидаясь охлаждения, так, чтобы частицы ЛРС не попадали в колбу. Количественное определение методом перманганатометриипроводили, как описано в Главе 2 (п. 2.2.9).Рис. 158. Содержание ДВ в зависимости от способа фильтрованияСледует отметить, что для изучаемого ЛРС желатиновый метод оказался непригодным,так как при добавлении раствора желатина к водной вытяжке, выраженный осадок не образовывался [303].Согласно современным представлениям, истинное содержание ДВ возможно определитьметодом спектрофотометрии, в основе которого лежит измерение оптической плотности спирто-водной вытяжки из ЛРС при длине волны 275±2 нм. В настоящее время данный метод считается более избирательным для ДВ и, как следствие, более объективным.
При изучении спектров поглощения водных извлечений в диапазоне длин волн 200-500 нм, было установлено, чтоводные извлечения, разведенные 70% этанолом в соотношении 1:10, имели максимум придлине волны 277±1 нм. Аналогичный максимум отмечен для раствора РСО танина на 70%спирте (рис. 159). Это дало возможность использовать длину волны 277±1 нм в качестве аналитической для разработки методики количественного определения ДВ в сырье методом спектрофотометрии.оптическая плотность2980,310,220,10200220240260280длина волны, нм300320Рис. 159.
Спектр поглощения растворов в 70% этаноле в диапазоне длин волн 200-320 нм (1 –РСО танина; 2 – извлечение из листьев крапивы двудомной)Количественное определение методом спектрофотометрии. Отбирают 5 мл полученного извлечения в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки 70% этанолом. Измеряют оптическую плотность полученного раствора относительно 70% этанола при длине волны 277±1 нм.Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО танина. Содержание ДВ (X4) в пересчете на танин в процентах в пересчете на абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле 32:Х 4 ,%Ax 0,05 125 100 100 50 2,5 1Ах 25Ao 5 a (100 W ) 100 25 25а Ао (100 W )(32)Ах – оптическая плотность исследуемого извлечения при длине волны 277±1 нм; а – масса сырья, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %; Ао – оптическая плотность РСО танинапри длине волны 277±1 нм.Известен также метод спектрофотометрического количественного определения суммыДВ в пересчете на кислоту галловую в боратном буферном растворе с рН=9,0 [234].
В методе,по данным авторов [198], проведению анализа препятствует многократное разведение испытуемого раствора и использование буфера в качестве раствора сравнения. Однако, результаты,полученные по двум спектрофотометрическим методикам (СФ-метод определения суммы ДВ впересчете на танин в водно-спиртовой среде и СФ-метод определения суммы ДВ в пересчете нагалловую кислоту в боратном буферном растворе с рН=9,0) оказались сопоставимыми (таблица194).Описаны в литературе также способы спектрофотометрического количественного определения ДВ, основанные на образовании окрашенных комплексов ДВ с железо-тартратным реактивом [17].
Следует отметить, что метод не может быть рекомендован для этих целей, так каканалитический максимум на спектре поглощения извлечения с реактивом оказывался батохромно сдвинут на 12 нм относительно ожидаемого (522 нм), в результате чего были полученызаниженные результаты (в пересчете на галловую кислоту) при его использовании (таблица194). Статистическая обработка экспериментальных данных представлена в таблице 195.299Таблица 194Сравнительная оценка содержания ДВ в листьях крапивы двудомной различными методами[303,327]№Название методаСодержание суммып/пДВ, %1Перманганатометрия7,47±0,552Желатиновый метод3,16±0,233СФ-метод определения суммы ДВ в водно-спиртовом рас2,75±0,08творе в пересчете на танин4СФ-метод определения суммы ДВ в пересчете на галловую3,12±0,076кислоту (значение удельного показателя поглощения)5СФ-метод определения суммы ДВ в пересчете на галловую3,02±0,074кислоту (сравнение со стандартным образцом)6СФ-метод определения суммы ДВ с железо-тартратным3,94±0,45реактивом в пересчете на танин7СФ-метод определения суммы ДВ с железо-тартратнымреактивом в пересчете на кислоту галловую0,89±0,10Таблица 195Метрологическая оценка методики определения (P = 95 %; n = 4)S2SSxcp∆x∆xcpε, %εср, %Метод перманганатометрии7,470,120,3460,1731,10,5514,737,36Метод спектрофотометрии определения суммы ДВ в водно-спиртовом растворе впересчете на танин2,750,000070,00850,0060,108 0,0773,932,80СФ-метод определения суммы ДВ в пересчете на галловую кислоту2,990,004860,06970,0284 0,179 0,0735,992,45xсрДля идентификации и количественного определения в сумме ДВ танина и кислоты галловой была использована разработанная ТСХ-методика (Глава 3, п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
