Диссертация (1139719), страница 54
Текст из файла (страница 54)
Следует отметить, что при однократном хроматографировании, даже при высоте пробега элюента более 13 см, разделение зон изучаемыхБАВ следует считать неполным, ввиду богатого набора пигментов в листьях крапивы двудомной.Рис. 141. Разделение липофильных пигментов 40 мкл извлечения из листьев крапивы двудомной на пластинах ПТСХ-АФ-А при просмотре в видимом свете279Таблица 180Характеристики эффективности разделения БАВ изучаемого ЛРС на различных типах ТСХпластин [330]№ВЭТТ,Цвет зоныRf±0,02NПВЭТТКLзонымкмна хроматограммеПТСХ-АФ-А10,0340,03,0272,739,0Серовато-зеленая20,0982,81,5131,89,94,0Желтая30,15134,80,980,85,71,7Оранжево-желтая40,21333,30,432,73,81,5Оранжево-желтая50,26413,80,326,42,91,3Светло-зеленая60,36324,30,433,81,81,6Желтая70,41235,30,546,41,41,2Светло-зеленая80,45131,90,982,51,21,2Светло-зеленая90,58169,00,764,60,71,7Ярко-зеленая100,64255,30,542,50,61,3Светло-зеленая110,72285,70,438,10,41,4Зеленая120,77307,70,435,60,31,3Темно-зеленая130,88157,90,869,50,12,3Серовато-зеленая140,9469,41,7157,70,12,2Зеленовато-серая150,9855,32,2197,20,023,0ОранжеваяПТСХ-П-В10,018,316,01600,0124,1Серовато-зеленая20,0333,34,0400,032,33,8Желтая30,0853,22,5250,012,32,6Оранжево-желтая40,1285,31,6156,07,31,7Оранжево-желтая50,16175,00,876,05,31,4Светло-зеленая60,19207,80,664,04,31,2Желтая70,29207,80,664,02,41,8Светло-зеленая80,38271,40,549,01,61,5Светло-зеленая90,42458,60,329,01,41,2Ярко-зеленая100,49532,00,325,01,11,3Светло-зеленая110,57403,00,333,00,81,4Зеленая120,60424,90,331,00,71,2Темно-зеленая130,80143,00,993,00,32,8Серовато-зеленая140,88633,30,221,00,21,7Зеленовато-серая150,98103,11,3129,00,027,0ОранжеваяВ одной визуализирующейся хроматографической зоне может содержаться нескольковеществ с похожими параметрами удерживания в данных условиях анализа.
Использованиехроматографирования в двух проекциях позволило найти решение данной задачи (рис. 142).Двумерная ТСХ, в отличие от одномерной, по разрешающей способности сравнима с колоночной хроматографией [39]. На основании результатов, полученных ранее, двумерное разделениеизучаемых БАВ в МЭ и ЛРС проводили на пластинах размером 10×10 см марки «Sorbfil» (типПТСХ-П-В).280(1)(2)Рис. 142. Хроматограммы двумерного разделения пигментов при просмотре в видимом свете напластинах ПТСХ-П-В: 1 –МЭ листьев крапивы; 2 - извлечение из листьев крапивыРазделение в двух направлениях в элюенте петролейный эфир-этанол (16:1) позволилополучить наилучшие качество и параметры разрешения зон пигментов на хроматограммах.Хроматограммы двумерного разделения БАВ МЭ и извлечения из листьев крапивы двудомнойпоказаны на рис.
142.При хроматографировании извлечений из листьев крапивы двудомной на хроматограммах обнаруживалось 17 зон каротиноидов и хлорофиллов, идентифицированных по определенной окраске пятен в видимом свете. Хроматограммы МЭ листьев крапивы двудомной характеризовались присутствием 4 зон (две каротиноидной и две хлорофилловой природы), являющиеся общими с ЛРС (таблица 181). Экспериментально установлено, что очень незначительнаячасть даже липофильных пигментов экстрагируются жирным маслом, что согласуется с данными, полученными при количественном определении.Величина Rf для разделяемых веществ, в случае двумерного хроматографирования, в литературе, как правило, не приводится в качестве критерия оценки подлинности. Вероятно, этоможет быть связано со значительным ростом ошибки в расчете данного параметра.
Для оценкикачества ЛРС, характеризующегося присутствием комплекса БАВ липофильной и гидрофильной природы, в настоящее время предложено использовать метод «print-fingers - отпечаткипальцев» на хроматограммах. Для оценки расположения зон на хроматограммах, в случаяхдвумерного хроматографирования, целесообразнее использовать их пространственные координаты, в качестве которых могут быть рекомендованы длины пути, пройденного пятном. Характеристика уникальных хроматографических профилей липофильных БАВ ЛРС и МЭ листьевкрапивы приведена в таблице 181.281Таблица 181Характеристика уникальных «отпечатков пальцев» БАВ ЛРС и МЭ крапивы двудомной(Z01=Z02=5 мм и Zf1=92 мм; Zf2=85 мм) [330]№ зоны Zx1±2, ммZx2±2, ммЦвет зоны на хроматограммахБАВЛРС18776Желтовато-оранжеваяβ-каротин*27766Зеленовато-сераяХлорофилл*36827ЗеленаяХлорофилловыесоединения45542Серовато-зеленая55527Ярко-зеленая65517Зеленая75513Зеленая8551Зеленая94032ЖелтаяКсантофилл104030ЗеленаяХлорофиллы113217Светло-зеленая12328ЖелтаяКсантофилл13321ЖелтаяКсантофилл142417ЖелтаяКсантофилл*151510ЖелтаяКсантофиллы1654Желтая1721Серовато-зеленаяХлорофилл*Zf - путь, пройденный подвижной фазой, мм; Z0 - расстояние от линии погружения до линиистарта, мм; Zx1 - длина пути, пройденного пятном в направлении первого элюирования, мм; Zx2- длина пути, пройденного пятном в направлении второго элюирования, мм.*- зоны, присутствующие в МЭ листьев крапивы двудомной.Разные виды ЛРС содержат уникальный набором пигментов, что связано с особенностями биохимических процессов, поэтому полученные виды двумерного разделения пигментовЛРС и МЭ крапивы двудомной на хроматограммах (рис.
142) могут быть использованы в качестве дополнительного критерия для оценки их качества. Хроматографический профиль пигментов ЛРС и МЭ на хроматограммах целесообразно использовать для проведения сквозной стандартизации, используя метод «отпечатков пальцев».6.2. Определение гидрофильного комплекса БАВ листьев крапивы6.2.1. Определение органических кислот в листьях крапивы двудомнойОдним из классов соединений, проявляющих широкий диапазон биологической активности, являются ОК. Они обладают антиоксидантной, противовоспалительной, иммуномодулирующей, кератолитической активностью, принимают участие в обмене веществ, положительновлияют на усвоение пищи, создают благоприятные условия для жизнедеятельности полезныхмикроорганизмов кишечника.282Анализ литературы за последние 20 лет, показал, что большая часть публикаций по количественному определению суммы ОК в ЛРС посвящена методу алкалиметрии [19,91,94,95,111,249]. Метод кулонометрического титрования описан авторами для определения суммы кислот в плодах различных представителей семейства розоцветных [178,213,224,249].
Среди хроматографических методов наибольшее значение в контроле качества данных БАВ занимает метод ТСХ, используемый для оценки качественного состава кислот в различных видах ЛРС[19,111,279].Листья крапивы двудомной богаты кремниевыми и ОК. Согласно НД, определение ОК всырье не предусмотрено [91,93]. За основу, при разработке методики, была взята методика, рекомендованная ГФ XI (ФС «Плоды шиповника») [91]. Экспериментальным путем установлено,что оптимальным соотношением ЛРС и экстрагента для извлечения суммы ОК является 1:250(таблица 182), а наилучшее время экстракции составляет 2 часа (рис.
143).Максимальное содержание данных БАВ в извлечении наблюдается при использованиичастиц сырья, проходящего через сито с размером отверстий 1 мм (рис. 144).Таблица 182Результаты количественного определения суммы ОК в извлечениях из листьев крапивы двудомной (ЛРС – экстрагент) [285]№ п/пЛРС:ЭкстрагентНайдено суммы ОК, %1234561:251:501:1001:2501:3001:5001,16±0,0861,04±0,0774,19±0,3104,45±0,3303,09±0,2291,45±0,107Рис. 143. График зависимости извлечения суммы ОК из листьев крапивы двудомной от времениэкстракцииПолучение извлечения и определение содержания суммы свободных ОК проводили алкалиметричеким методом, как описано в Главе 2 (п. 2.2.3).283Рис.
144. Диаграмма зависимости содержания суммы ОК в извлечении от размера частиц ЛРССумма ОК в ЛРС представлена ГКК, АсК и другими карбоновыми кислотами. АсК вЛРС различных видов традиционно определяют титриметрическим методом [91]. Поэтому наследующем этапе работы была адаптирована для листьев крапивы двудомной известная фармакопейная методика количественного определения витамина С в ЛРС. Определение содержанияАсК проводили фармакопейным методом, как описано в Главе 2 (п. 2.2.5).Определение суммы ГКК проводили по разработанной методике, как описано выше (п.6.1) [319]. Доля важнейших кислот – АсК и ГКК в общей сумме ОК листьев крапивы двудомной приведены на рис.
145.Для определения влияния времени кипячения на выход и стабильность ОК, а также длясравнения полученных данных количественного определения с результатами содержания кислот в настое, приготовленном в домашних условиях, проводили определение БАВ в извлечении, полученном по методике ОФС «Настои и отвары» ГФ XIII [93] и согласно рекомендациямна упаковке (таблица 183).Рис. 145.
Распределение ОК в общей сумме в извлечении из листьев крапивы двудомной, приготовленном по методике ГФ XIII284Таблица 183Сравнительная оценка содержания суммы ОК в листьях крапивы двудомной при различныхспособах приготовления извлечения [285,309]№Название методаСодержание суммы ОК, %Содержание АсК, %п/п1Получение настоя по ГФ1,559±0,1160,042±0,003XIII2Получение настоя как1,460±0,1080,115±0,008указано на упаковке3По методике авторов4,450±0,3300,378±0,027Наблюдается повышение выхода кислот с увеличением времени экстракции ЛРС.
Результаты определения содержания суммы ОК в листьях крапивы двудомной представлены втаблице 183, статистическая обработка экспериментальных данных представлена в таблице 184.Таблица 184Метрологическая оценка методики определения (P = 95 %; n = 5)xсрS2SSxcp∆x∆xcpεср, %Сумма ОК, %4,010,05670,2380,10670,6620,2977,41АсК, %0,1150,0000270,00520,00260,165 0,00837,196.2.2. Определение флавоноидов в листьях крапивы двудомнойСведения по определению суммы флавоноидов в пересчете на кверцетрин в листьях крапивы таких видов, как узколистная, жгучая и коноплевая представлены в литературе [344]. Содержание флавоноидов в листьях крапивы двудомной по НД не регламентируется [91,93]. Темне менее, стандартизация ЛРС, в том числе обладающего кровоостанавливающей активностью,по содержанию флавоноидов является весьма актуальной.Методом ТСХ в спиртовом извлечении из сырья крапивы двудомной идентифицированыфлавоноиды по характерной флюоресценции в УФ-свете, одним из которых являлся рутин всравнении с достоверным стандартным образцом.Для количественного определения флавоноидов за основу была взята фармакопейнаяметодика, основанная на их способности образовывать окрашенный комплекс со спиртовымраствором алюминия хлорида [18,133,215, 241,347, 356,357,373], с аналитическим максимумомпоглощения при длине волны 411±2 нм (рис.
146). Подобный максимум поглощения при 412±2нм отмечался для комплекса стандартного образца рутина со спиртовым раствором алюминияхлорида (рис. 146).285Рис. 146. Спектры поглощения (1 - спиртового извлечения из листьев крапивы двудомной(1:50), разведенного в 20 раз относительно спирта; 2 - комплекса спиртового извлечения салюминия хлоридом относительно спирта; 3 - дифференциальный спектр поглощения комплекса извлечения с алюминия хлоридом)Установлено, что максимум оптической плотности после добавления комплексообразователя к извлечению достигается через 15 минут и сохраняется в течение 1 часа.