Диссертация (1139719), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Для расчета количественного содержанияизучаемых групп БАВ использовали значения удельных показателей поглощения, представленные в литературе [110,138].оптическая плотность0,40,30,20,1300400500600700длина волны, нмРис. 133. Спектр поглощения извлечения из листьев крапивы двудомнойВыбор экстрагента осуществляли на основании полученных данных по влиянию полярности растворителя на извлечение изучаемых БАВ (рис. 134). Установлено, что с увеличениемполярности до 6,0 единиц происходит повышение их экстрагируемости. Дальнейшее увеличение полярности экстрагента нецелесообразно. Оптимальным экстрагентом является 70% этанол[202,319].Количественное определение. Около 0,5 г (т.н.) ЛРС, со степенью измельченности менее1 мм, экстрагировали в плоскодонной колбе объемом 100 мл с 50 мл 70% этанола в течение 30мин. После охлаждения извлечение декантировали и фильтровали через бумажный фильтр вмерную колбу объемом 100 мл.
Остаток в колбе заливали 50 мл 70% спирта этилового и экстрагировати еще раз в течение 30 мин.266Рис. 134. Влияние полярности экстрагента на извлечение изучаемых групп БАВОбъединенные извлечения в мерной колбе доводили 70% этанолом до метки (раствор А). 2 млраствора А переносили в мерную колбу объемом 25 мл и доводили объем 95% этанолом дометки (раствор Б).
Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (РФ) в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 328±1 нм, 442±1 нм и 667±1нм. Раствором сравнения служил 95% этанол. Содержание суммы ГКК (в пересчете на хлорогеновую кислоту), каротиноидов (в пересчете на виолоксантин) и хлорофилла в процентах (X) впересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по формулам (28-30) соответственно:X ,%X ,%X ,%A W1 W2 100 % 100 %m E1см1%100 Va (100 % В%)A W1 W2 100 % 100 %m E1см1%100 Va (100 % В%)A W1 W2 100 % 100 %m E1см1%100 Va (100 % В%)A 100 25 100 100m 507 100 2 (100 В)A 250000m 507 2 (100A 100 25 100 100m 2500 100 2 (100 В)A 100 25 100 100m 944 ,5 100 2 (100 В)В)A 100m 2 (100 В)A 250000m 944 ,5 2 (100 В)(28)(29)(30)где А - оптическая плотность раствора Б в соответствующем максимуме поглощения; m - массасырья, г; В - потеря в массе при высушивании сырья, %; Е1см1% - удельный показатель поглощения, равный 507 для хлорогеновой кислоты при 327±1 нм, 2500 для виолоксантина при 442±2нм и 944,5 для хлорофилла при 663±5 нм; W1 и W2 - объемы мерных колб, использованных дляразведения, мл; Va – объем аликвоты, взятый на анализ, мл.Поскольку в методику [138] введено дополнительное количественное определение суммы каротиноидов, были установлены такие валидационные характеристики, как повторяемостьи точность.
Валидационные характеристики определения суммы ГКК и хлорофилла приведеныв работе [138]. Результаты представлены в таблицах 171 и 172.267Таблица 171Результаты исследования повторяемости методики спектрофотометрического определениясуммы каротиноидов в присутствии ГКК и хлорофиллов в листьях крапивы двудомной [319]КаротиноидыПробаХ,%Результаты10,194220,2087xср±∆xcp= 0,2098±0,0094;30,2062SD=0,009;40,2137RSD=4,29%50,218060,2180Таблица 172Результаты исследования точности методики спектрофотометрического определения суммыкаротиноидов в присутствии ГКК и хлорофиллов в листьях крапивы двудомной [319]НавескаНайдено, %Расчетное соR, %МетрологическиеЛРСдержание, %характеристики0,12200,2137102,300,12000,2184104,550,12210,208799,90SD=0,008290,50000,2159103,35RSD=3,97%0,49370,202396,840,2098εср.=3,12%0,50160,2180104,36хср.± Δх=1,00000,202797,030,2089±0,00651,00100,206298,710,99910,194292,96хср.=0,2098Rср.= 100,00Точность методики устанавливали на 9 образцах и 3-х уровнях концентраций.
Для оценки полученных результатов наглядным критерием служит открываемость (R). При проведениианализа установлено среднее значение R (таблица 172). Статистическая обработка результатовпозволила вычислить величину относительного стандартного отклонения RSD. Согласно результатам (таблицы 171 и 172), полученные экспериментально и вычисленные теоретическизначения суммы каротиноидов практически полностью совпадают.
R для каротиноидов –100,00%. Для более точной оценки сопоставили величины RSD, вычисленные при определенииповторяемости и точности методики. Они близки по значениям (4,29 и 3,97%) и не превышают5%, что свидетельствует о точности и прецизионности методики в условиях повторяемости, азначит, возможности ее использования для стандартизации и оценки качества листьев крапивы[21,22,107].Для оценки достоверности, полученные результаты были сравнены с литературнымиданными по определению изучаемых групп БАВ в различных видах растения рода Urtica ssp.[100,138,141,206,264,293,344,346,380] (таблица 173).268Таблица 173Содержание ГКК, каротиноидов и хлорофилла в различных видах растения рода Urtica[100,138,141,206,264,293,344,346,380]№Часть расМетодСодержаниеВид крапивып/птенияопределенияБАВ, %ГКК1Крапива коноплевая2,03±0,042Крапива двудомная2,49±0,0002листСФКрапива двудомная (экспери32,03±0,02ментальные данные)каротиноиды1Крапива коноплевая0,57±0,05ФЭК0,499±0,03лист2Крапива двудомнаяВЭЖХ0,541±0,053Крапива двудомнаятраваСФ0,108±0,001Крапива двудомная (экспери4листСФ0,210±0,010ментальные данные)хлорофиллы1Крапива коноплеваялист0,760±0,022Крапива двудомнаятраваСФ0,2113±0,0070Крапива двудомная (экспери3лист0,3714±0,0074ментальные данные)Полученные экспериментальные данные, сопоставимы с результатами исследований,проведенными другими авторами с использованием различных методик [100,138,141,206,264,293,344,346,380], что свидетельствуют о достоверности результатов определения БАВ при модификации известной ранее методики.
Валидация методики показала возможность ее использования для стандартизации и оценки качества листьев крапивы двудомной.6.1.2. Разработка ТСХ-методики разделения и определения липофильных пигментовлистьев крапивы двудомнойОсновными природными пигментами листьев являются производные хлорофилла, каротина и ксантофилов, составляющие комплекс липофильных БАВ [138,380]. В литературе имеется противоречивая информация по качественной идентификации данных БАВ методом ТСХ[141]. Отсутствуют единые подходы к определению пигментов, а также теоретическое обоснование выбора параметров хроматографического анализа. Поэтому актуальным является экспериментальное и теоретическое обоснование выбора оптимальных условий хроматографирования, позволяющих провести разделение и идентификацию пигментов листьев крапивы двудомной в тонком слое сорбента.269Извлечения готовили путем обработки ЛРС экстрагентом в соотношении 1,5:100 принагревании на водяной бане с обратным холодильником в течение 20 минут.
В качестве экстрагента был выбран ацетон, обладающий максимальной извлекающей способностью в отношениипигментов изучаемых групп [110,284]. Полученные фильтровали через бумажный фильтр, отбрасывая первые порции фильтрата, и хроматографировали в количестве 40 мкл на пластинахмарки «Sorbfil» ПТСХ-УФ.Экспериментально исследовано более десяти типов элюентов в диапазоне Р системы от0,13 до 6,68 ед. (таблица 174). В литературе для этих целей чаще всего предлагаются многокомпонентные системы [110,132,141,374].Таблица 174Характеристика элюирующих систем [284]№ п/пПодвижная фазаР1А-ПЭ (3:7)1,622ПЭ-Эт (16:1)0,313ПЭ-М (98:2)0,134ПЭ-А (95:5)0,275М-А-В (20:4:3)6,686ПЭ-Х (3:1)1,107ПЭ-Бз-А-У (80:20:2:1)0,758ПЭ-А (1:1)2,709Э-У-В (7,5:1,5:1,5)5,2410ПЭ-А-П (90:10:45)1,6411Г-П-В (50:5:0,25)0,41А – ацетон; ПЭ – петролейный эфир; Эт – этанол; М – метанол; В - вода; Х – хлороформ; У –ледяная уксусная кислота; Бз – бензол; Э - этилацетат; П – пропанол; Г - гексанВид полученных хроматограмм представлен на рис.
135. Для обоснования возможностииспользования теоретического подхода к выбору оптимальных условий хроматографическогоразделения пигментов листьев крапивы, необходимо было изучить влияние полярности элюентов на их подвижность в тонком слое (рис. 136).Для каждой элюирующей системы рассчитаны хроматографические параметры изучаемых пигментов: величина R , коэффициент распределения и величина селективности сорбции[39] (таблица 175). Идентификацию веществ на хроматограммах осуществляли в видимом иУФ-свете по характерному цвету зон и величинам Rf, описанным в литературе [110,132,374].Подвижные фазы № 5 и 9 не могут быть рекомендованы для хроматографического определения исслдуемых пигментов (рис. 135), поэтому они были исключены при дальнейшем анализе.
Величина Rf β-каротина зависит от Р системы в узком диапазоне от 0,1 до 0,4 ед. (рис.136). С ростом полярности до 0,5 ед.и более, β-каротин перестает удерживаться сорбентом,имея К→0,01.270Рис. 135. Хроматограммы извлечений из листьев крапивы двудомной в системах №1-11 (в УФсвете проявлялись неокрашенные зоны)Рис. 136. Графики зависимости хроматографической подвижности пигментов листьев крапивыдвудомной в тонком слое от полярности элюента271Таблица 175Идентификация и параметры хроматографического разделения зон БАВ на хроматограммахЦвет зоны№КИдентификацияRf±0,02L±0,01вУФ-светезоны±0,01БАВ [110,132,374]в видимом свете(365нм)1234567А-ПЭ (3:7)Хлорофилловое соеди10,165,32,6ЗеленыйРозовыйнение20,332,14,530,690,51,2ЖелтыйКсантофиллы40,730,41,550,800,31,360,840,22,5Светло-зеленыйХлорофилл bРозовый70,930,1Темно-зеленыйХлорофилл а3,880,980,02Оранжевыйβ-каротинПЭ-Эт (16:1)10,109,03,0Коричневый20,253,02,330,431,31,5Светло-зеленыйРозовыйХлорофилл b40,530,94,750,840,21,4ЖелтыйКсантофиллы60,880,141,570,920,1Темно-зеленыйРозовыйХлорофилл а2,180,960,04Оранжевыйβ-каротинПЭ-М (98:2)10,117,82,7Светло-зеленыйХлорофилл bРозовый20,262,91,2Темно-зеленыйХлорофилл а30,302,3Оранжевыйβ-каротин10,140,810,2ЖелтыйФлавоноидПЭ-А (95:5)Хлорофилловое соеди10,127,31,3ЗеленыйнениеРозовый20,165,54,0Светло-зеленыйХлорофилл b30,421,41,3Темно-зеленыйХлорофилл а40,491,11,4Оранжевыйβ-каротин50,580,7Флавоноид36,5Желтый60,980,02ФлавоноидПЭ-Х (3:1)Хлорофилловое соеди10,0811,51,4ЗеленыйнениеРозовый20,118,11,7Светло-зеленыйХлорофилл b30,174,9Темно-зеленыйХлорофилл а1,740,262,9ЖелтыйФлавоноидПЭ-Бз-А-У (80:20:2:1)10,165,31,420,213,81,3ЖелтыйКсантофиллы30,253,01,340,302,31,450,371,71,1Светло-зеленыйРозовыйХлорофилл b272167820,400,410,8431,51,40,241,046ЖелтыйРозовыйЖелтый7ФлавоноидХлорофилл аФлавоноид2,35Темно-зеленыйПЭ-А (1:1)-10,109,0Желтый4,01,2ЗеленыйРозовый0,230,950,983,40,10,0263,2РутинХлорофилловое соединениеХлорофилл bβ-каротинХлорофилл а20,20345123450,060,860,900,930,9515,70,20,10,080,0596,11,51,510,0051999,220,04421,712,830,371,73,8456780,690,910,960,970,990,50,10,040,030,014,62,21,47,62,71,43,1Светло-зеленыйРозовыйОранжевыйТемно-зеленыйРозовыйПЭ-А-П (90:10:45)-ЖелтыйРутинЖелтый-КсантофиллыРозовый-Хлорофиллы а и bβ-каротинЖелтыйРутинХлорофилловое соединениеЗеленыйОранжевыйГ-П-В (50:5:0,25)ЗеленыйРозовыйЖелтый-КсантофиллыОранжевыйСветло-зеленыйТемно-зеленыйЖелтыйРозовыйРозовый-β-каротинХлорофилл bХлорофилл аКсантофиллРис.
136 демонстрирует, что величина Rf хлорофиллов вариабельна при изменении полярности, однако, вид графиков зависимости сходен между собой, по-видимому, в виду похожих структур изучаемых пигментов. Оптимальные величины Rf пигментов листьев крапивыполучены в системах № 3 и 4. Однако, максимальный набор разделенных зон на хроматограммах, был характерен для систем №1,2,7 и 11. Определяющим фактором в выборе системы дляТСХ при анализе многокомпонентных смесей являются параметры эффективности и разрешения зон на хроматограммах.Заключение об эффективности хроматографического разделения выносилось на основании расчета таких параметров, как H и N [39].
Данные представлены в таблице 176. Вид зависимостей Н и N от Р системы для изучаемых БАВ листьев крапивы двудомной представлен нарис. 137.273абРис. 137. Зависимость величин N (а) и H (б) от полярности элюента (на примере хлорофиллов а,b и β-каротина)Таблица 176Характеристика эффективности хроматографических систем [284]БАВН, мкмNБАВН, мкмNЭлюирующая система №1Элюирующая система №8хлорофилл b657,9060,80хлорофилл b276921,67хлорофилл а595,2467,20хлорофилл а147040,82β-каротин363,64110,00β-каротин302198,68Элюирующая система №2Элюирующая система №10хлорофилл b181,82253,00хлорофилл b320,51246,48хлорофилл а191,49240,22хлорофилл аβ-каротин326,53140,87β-каротин112,5702,22Элюирующая система №3Элюирующая система №11хлорофилл b500,00130,00хлорофилл b1246,1550,56888,8973,131227,2751,33хлорофилл ахлорофилл а297,62218,401306,4548,22β-каротинβ-каротинЭлюирующая система №4Элюирующая система №7хлорофилл b2285,7117,50хлорофилл b695,6583,38473,6884,441384,6241,89хлорофилл ахлорофилл аβ-каротин727,2755,00β-каротин--Однако, наилучшая степень разделения пигментов на пластинках была достигнута в системе №2 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
