Диссертация (1139719), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Ярыгиной с соавторами,основанная на измерении оптического поглощения продуктов реакции водного извлечения изЛРС с нингидрином [195,227]. Спектры продуктов реакции комплекса АК извлечения из изучаемого сырья, при pH 6,4, характеризуются присутствием трех четко выраженных максимумовпоглощения при длинах волн 276±2 нм; 401±2 нм и 568±2 нм, а также 2 минимумов, лежащих вдиапазоне 350-360 нм и 460-480 нм.
В качестве аналитической используется длина волны 568±2нм. Максимумы светопоглощения продукта реакции стандартного образца глутаминовой кислоты с нингидрином находятся в области 276±2 нм; 401±2 нм; 568±3 нм, что позволяет рекомендовать данную АК в качестве стандарта (рис. 97).Установление стабильности окраски продуктов реакции выделенной суммы АК извлечения из плодов облепихи крушиновидной с нингидрином определяли путем анализа растворовпосле проведения реакции в течение 1 часа. Оптическая плотность достаточно стабильна и сохраняется в течение наблюдаемого периода, незначительно снижаясь к концу периода наблюдения [295].0,7Оптическая плотность0,60,50,420,30,2310,10190290390490590Длина волны, нмРис. 97. Спектры поглощения (1 – 0,025% водного раствора глутаминовой кислоты; 2 - продукта реакции глутаминовой кислоты с нингидрином; 3 - продуктов реакции водного извлеченияиз ЛРС с нингидрином)Для установления полноты экстракции АК из плодов изучали влияние таких параметров,как соотношение сырья и экстрагента (таблица 139), кратность и температура экстракции (рис.98), а также оптимальное временя экстрагирования (рис.
99). Наилучшим соотношением сырья219и экстрагента признано 1:70 (таблица 139). При оценке влияния кратности экстракции (таблица140) на выход АК в извлечение из плодов облепихи установлено, что увеличение кратностисначала приводит к повышению экстрагируемости АК, а затем сопровождается падением данного показателя. Это связано, по-видимому, со снижением времени контакта сырья с растворителем.Экстракцию АК из сырья проходит наиболее интенсивно при температуре кипения водяной бани, что сопровождается максимальным выходом АК в водное извлечение (рис. 98).
Согласно экспериментальным данным, оптимальное время экстракции составило 60 минут (рис.99).Таблица 139Выход АК в извлечение из плодов облепихи крушиновидной в зависимости от соотношениясырье-экстрагент [295]№ п/пЛРС:экстрагентСодержание суммы свободных АК, %11:103,308±0,22721:203,122±0,21431:303,373±0,23141:504,860±0,33351:706,020±0,41361:1004,018±0,276Таблица 140Содержание АК, %Выход АК в извлечение в зависимости от кратности экстракции [295]КратностьПлоды свежиеПлоды высушенныеэкстракции13,3730±0,23143,5430±0,040724,3875±0,30105,4210±0,062334,4180±0,30314,8930±0,05637654321001020 30 40 50 60 70 80Температура экстракции, град С90 100Рис.
98. Влияние температуры экстракции на выход АК в извлечениеВопросы стабильности суммы свободных АК при хранении свежего ЛРС в условиях заморозки ранее в литературе не рассматривались. Особенно актуальным является изучение влияния условий хранения плодов облепихи крушиновидной на содержание суммы свободных АК,220так как данное ЛРС традиционно используется в свежем виде, а также, согласно НД, можетСодержание БАВ, %храниться в замороженном состоянии в бочках до 6 месяцев.7654321015 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90Время экстракции, минРис.
99. Влияние времени экстракции на содержание АК в извлеченииС целью исследования стабильности АК и выбора оптимальных условий хранения плодов облепихи, количественное определение проводили в свежих, высушенных и замороженныхплодах. Установлено, что содержание АК в извлечениях из высушенных, свежих и плодов облепихи крушиновидной на различных этапах хранения в условиях заморозки различно (рис. 100и 101).
АК в свежих плодах содержатся как в свободном, так и в связанном виде (белковые соединения). При высушивании при температуре 60 0С и, даже в замороженном состоянии придлительном хранении, в клеточном соке ЛРС, богатом ОК, протекают процессы кислотногогидролиза, что может, сопровождается увеличением количества и изменением состава свободных АК в сырье [325].Содержание АК, %654,865,4243210свежиевысушенныеСпособ консервации плодовРис. 100. Влияние способа консервации плодов на содержание суммы свободных АКПолученные данные согласуются с результатами ТСХ-анализа (Глава 4, п. 4.4.1 и 4.4.2),которые позволили установить, что высушенные плоды более богаты свободными АК по качественному и количественному составу [297].221Рис.
101. Влияние условий хранения плодов облепихи крушиновидной на содержание суммысвободных АККоличественное определение. Около 3,0 г (т.н.) измельченного ЛРС экстрагировали в конической колбе объемом 250 мл с 100 мл воды очищенной на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Полученную вытяжку после быстрого охлаждения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 200 мл.
Фильтр с остатками сырьяпомещали в ту же колбу для повторного экстрагирования. Вторую порцию извлечения фильтровали через тот же бумажный фильтр, в ту же мерную колбу объемом 200 мл, отжимая остатки ЛРС. При необходимости, доводили раствор водой до метки (раствор А). 2 мл извлечения изсвежих плодов переносили в мерную колбу объемом 50 мл или 2 мл извлечения из высушенныхплодов переносили в мерную колбу объемом 100 мл, добавляли 2 мл 1% раствора нингидрина в96% этаноле, 4 мл фосфатного буферного раствора с рН 6,4 и 2 мл 0,05% водного раствора АсК.Реакционную смесь грели на кипящей водяной бане 30 мин; быстро охлаждали, объем растворадоводили до метки водой очищенной и перемешивали (раствор Б). Параллельно готовили контрольный опыт с 2 мл раствора В стандартного образца глутаминовой кислоты и 2 мл водыочищенной.
Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектрофотометре Hitachi U-1900 (Япония) при длине волны 568±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительноконтрольного опыта. Содержание суммы свободных АК в пересчете на кислоту глутаминовуюи на абсолютно сухое сырье в процентах (X) для свежего сырья вычисляют по формуле 20 илиформуле 21 для высушенного сырья:Х ,%Х ,%Ах 0,025 50 200 100 100 2A0 m 2 100 100 (100 W )Ах 0,025 100 200 100 100 2A0 m 2 100 100 (100 W )Ах 0,025 50 200А0 m (100 W )Ах 0,025 100 200А0 m (100 W )(20)(21)222А — оптическая плотность испытуемого раствора; А0 - оптическая плотность раствора РСОглутаминовой кислоты; m — масса сырья, г; W — потеря в массе при высушивании сырья, %.Приготовление раствора стандартного образца глутаминовой кислоты осуществляли как описано в Главе 2 (п.
2.7).Метрологическая оценка разработанной методики показала, что относительная ошибка сдоверительной вероятностью 95% составляет около 5%, т.е. находится в пределах случайнойошибки предложенной методики (таблица 141).Таблица 141xсрS23,0390,0404,4240,002Метрологическая оценка метода анализа (Р=95%)SSxcpt (P,t)∆x∆xcpПлоды облепихи свежие0,l990,0802,570,5l10,208Плоды облепихи высушенные0,04l10,0l82,780,l140,051εср, %Sr, %6,866,53l,l50,927Высушенные плоды были использованы при проведении валидационных исследований.Установлены следующие валидационные характеристики данной методики: линейность, пределопределения, специфичность, повторяемость и внутрилабораторная воспроизводимость. Содержание АК в пересчете на кислоту глутаминовую в образцах ЛРС составило 4,42382±0,050915% (принятое опорное значение).Специфичность методики определяли методом добавок.
Спектр поглощения продуктовреакции АК извлечения из плодов облепихи крушиновидной с нингидрином, при введении РСОкислоты глутаминовой, имеет одинаковый вид с гиперхромно сдвинутыми максимумами свето-Оптическая плотностьпоглощения при 280±2; 401±2 и 568±2 нм (рис. 102).0,6Ряд10,5Ряд20,40,30,20,10200300400500600700Длина волны, нмРис.
102. Вид спектра поглощения продуктов реакции извлечения из плодов облепихи крушиновидной с нингидрином (ряд 1 – без добавки РСО кислоты глутаминовой: ряд 2 – с добавкойРСО кислоты глутаминовой)Линейность определяли на пяти уровнях концентраций. Испытуемые растворы готовилипутем увеличения аликвоты по схеме: аликвота раствора А от 1,0 до 2 мл – объем раствора Б100,0 мл (50,0 – 100,0%).
Критерий приемлимости – коэффициент корреляции не менее 0,995223(рис. 103). Другие характеристики линейности (наклон прямой, отрезок на оси ординат) приведены в таблице 142.Оптическая плотность0,80,70,6y = 0,0681x - 0,056R² = 0,99550,50,40,30,20,10581114содержание суммы АК в пересчете на кислотуглутаминовую в извлечении, г×10-4Рис. 103. Линейная зависимость оптической плотности раствора от содержания суммы АК в пересчете на кислоту глутаминовую (г×10-4) в извлечении из плодов облепихи крушиновиднойТаблица 142Результаты валидационной оцени методики спектрофотометрического количественного определения суммы свободных АК в пересчете на кислоту глутаминовую в плодах [295]Статистические характеристикиРезультатыОценка линейности методикиУравнение регрессииу=0,0681х-0,0562R0,9955Диапазон линейности (грамм БАВ в 1 мл раствора)5,813 – 11,626×10-4Оценка прецизионности методики по показателю сходимостьпробаОптическая плотностьСодержание АК, %10,3004,373320,3044,431630,3094,504540,3074,475350,3054,4462Оценка прецизионности методики по показателю внутрилабораторная воспроизводимостьпробаHitachi U-1900 (Япония)СФ-2000 (Россия)Результаты количественного определения, %14,37334,052624,43164,074434,50454,175044,47534,148854,44623,8776Валидационные характеристики4,42382±0,0509154,06568±0,144844,3733 - 4,50453,8776 - 4,1750SD=4,103SD=11,671RSD=0,927RSD=2,871Предел определения, гКоличество грамм БАВ в 1 мл раствора0,7785×10-4224Внутрилабораторную воспроизводимость методики определяли согласно общепринятымрекомендациям [21].
Результаты, полученные при статистической обработке, достоверны придоверительной вероятности 95%, свидетельствуют о прецизионности методики в условиях повторяемости.Для обоснования наилучшего способа выделения АК из изучаемого ЛРС в домашнихусловиях, проводили количественное определение суммы свободных АК в отваре (таблица143).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
